實(shí)驗(yàn)二血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

實(shí)驗(yàn)二血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳第1頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握電泳法分離蛋白質(zhì)的原理2、學(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)的原理和操作方法3、學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)染色的方法第2頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六分離蛋白質(zhì)的方法分離方法沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法層析法電學(xué)法電泳法等電聚焦超速離心法離子交換層析吸附層析凝膠過(guò)濾（分子篩）親和層析第3頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)原理

電泳：是指帶電粒子在電場(chǎng)中向本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。在一定pH條件下，不同的蛋白質(zhì)由于具有不同的等電點(diǎn)而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場(chǎng)中它們的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此，可對(duì)它們進(jìn)行分離。第4頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六以蛋白質(zhì)為例：H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI第5頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六影響電泳遷移率的因素：

1、內(nèi)在因素：蛋白所帶凈電荷的性質(zhì)和電荷的量、蛋白的大小和形狀

2、外界因素：電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的pH值、溶液的離子強(qiáng)度和電滲現(xiàn)象常見(jiàn)的電泳有：

1、醋酸纖維膜電泳、

2、聚丙烯酰胺凝膠電泳、

3、毛細(xì)管電泳第6頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六負(fù)極正極－－－－－－－－表面帶負(fù)電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負(fù)極移動(dòng)

如果樣品原本是移向負(fù)極的，則泳動(dòng)的速度加快；如果樣品原本是移向正極的，則泳動(dòng)的速度減慢。電滲作用：電滲：在電場(chǎng)作用下液體對(duì)固體支持物相對(duì)移動(dòng)的現(xiàn)象。＋＋＋＋＋＋＋＋以紙電泳為例:第7頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六血清中幾種主要蛋白組分：血清蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分子量占總蛋白的％清蛋白4.64

69,00057～72α1－球蛋白5.00

200,0002～5α2－球蛋白5.06300,000

4～9β－球蛋白5.1290,000～150,0006.5～12γ－球蛋白6.85～7.3156,000～950,00012～20

緩沖液pH=8.6

pI＜pH血清蛋白帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)第8頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六醋酸纖維薄膜電泳醋酸纖維薄膜作為支持介質(zhì)醋酸纖維薄膜：將纖維素的羥基乙?；癁榇姿狨?，溶于丙酮后制成有均一細(xì)密微孔的薄膜，其厚度為0.1～0.15mm

第9頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六染色劑一般蛋白質(zhì)染色常使用氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、麗春紅糖蛋白用甲苯胺藍(lán)或過(guò)碘酸-Schiff試劑脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色

第10頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)器材1、電泳儀及電泳槽2、醋酸纖維薄膜（2×8cm）3、培養(yǎng)皿4、點(diǎn)樣器（蓋玻片）5、濾紙6、玻璃板（可用大培養(yǎng)皿背面代替）7、鑷子8、毛細(xì)管9、刀片第11頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)試劑1、巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH8.6，0.07mol/L，離子強(qiáng)度0.06)2、0.5%氨基黑10B染色液3、漂洗液100ml4、透明甲液和乙液各20ml5、人血清（嚴(yán)格防止血清沾到皮膚上，尤其是帶有傷口的皮膚）第12頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)操作1.醋酸纖維素薄膜的潤(rùn)濕與選擇

將醋酸纖維素薄膜浸于緩沖液中約30min后，取醋酸纖維素薄膜放在濾紙中并吸干表面液體。整條薄膜顏色一致而無(wú)白色斑點(diǎn)，則表明薄膜質(zhì)地均勻(實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選擇質(zhì)地均勻的膜)。2.電泳槽的準(zhǔn)備

電泳槽有兩個(gè)互相隔離的槽，各自裝有緩沖液，接不同的電極，紅色為正極，黑色為負(fù)極。每個(gè)槽上都有一根可移動(dòng)的橫桿，濾紙的一頭搭在橫桿上，另一頭浸入緩沖液中，形成濾紙橋。第13頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3.點(diǎn)樣：

點(diǎn)樣前，取一張干凈的濾紙，在距一邊1.5cm處用鉛筆劃一條平行線作為點(diǎn)樣標(biāo)志區(qū)。點(diǎn)樣時(shí)，用毛細(xì)管吸取血清，在蓋玻片一端均勻涂抹，使樣品連續(xù)、均勻、適量，把蓋玻片在薄膜毛面上輕而溫和地印一下（蓋章法）。點(diǎn)樣區(qū)距陰極端1.5cm（見(jiàn)圖）。此步是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。

醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點(diǎn)樣位置示意圖（黑線處為點(diǎn)樣位置）

點(diǎn)樣區(qū)6.5cm1.5cm第14頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六4.電泳

將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn)樣面朝下），另一端平貼在陽(yáng)極端支架上。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。連接好電泳儀。在室溫下電泳，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度0.3mA/cm膜寬度（8片薄膜則為4.8mA）。通電10-15min后，調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度0.5mA/cm膜寬度（8片薄膜則為8mA），電泳時(shí)間50-80min。電泳后，調(diào)節(jié)旋鈕使電流為零，關(guān)閉電泳儀切斷電源。第15頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六5.染色：電泳完畢后將薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中浸泡5min，染色時(shí)可置于搖床，染色液用后回收到原瓶。6.漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次，直至背景藍(lán)色脫盡，條帶清晰為止，取出薄膜放在濾紙上，用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干或者自然晾干。7.透明將干燥的薄膜浸入透明甲液2min后轉(zhuǎn)入乙液1min，取出后貼于干凈玻璃板上，中間不能有氣泡，等待至薄膜透明，如果透明太慢可用乙液淋洗一次。透明后冷風(fēng)吹干燥，置于自來(lái)水下沖洗，等薄膜濕潤(rùn)后用刀片從一角撬開(kāi)并輕輕取下，濾紙吸干水分后即可。如需長(zhǎng)期保存可在液體石蠟中浸潤(rùn)。第16頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六8.記錄和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

透明后可將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對(duì)位置進(jìn)行描述、記錄，并判斷分析結(jié)果。透明后的薄膜可作掃描或照相。正常人血清醋酸纖維素薄膜電泳示意圖

1．為清蛋白，2，3，4，5，分別為α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白，6為點(diǎn)樣原點(diǎn)

第17頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六注意事項(xiàng)1、薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。2、點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，薄膜吸水量以不干不濕為宜。3、點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞薄膜或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。4、點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的毛面上，點(diǎn)樣量要適量，不宜過(guò)多或過(guò)少。5、電泳時(shí)應(yīng)將薄膜的點(diǎn)樣端置于電泳槽的負(fù)極端，且點(diǎn)樣面向下。6、應(yīng)控制染色時(shí)間。時(shí)間長(zhǎng)，薄膜底色不易脫去；時(shí)間太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時(shí)可進(jìn)行復(fù)染。第18頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六思考題1.用醋酸纖維薄膜電泳做電泳支持物有什么優(yōu)點(diǎn)？2.電泳時(shí)為什么要將點(diǎn)樣的一端靠近負(fù)極端？3.電泳圖譜清晰的關(guān)鍵是什么？如何正確操作？第19頁(yè)，共20頁(yè)，2023年，2月20日，星期六小知識(shí)：血清蛋白電泳結(jié)果的臨床意義可