基因功能分析的基本策略演示文稿

基因功能分析的基本策略演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有70頁\編輯于星期五基因功能分析的基本策略現(xiàn)在是2頁\一共有70頁\編輯于星期五轉(zhuǎn)基因模型是研究基因功能的主要手段轉(zhuǎn)基因生物：外源基因?qū)肷矬w表達(dá)?；虼虬校和庠椿蛱鎿Q內(nèi)源基因?；蚯贸??；蚯萌搿；虺聊簩?dǎo)入特定基因，抑制內(nèi)源性基因表達(dá)。現(xiàn)在是3頁\一共有70頁\編輯于星期五第一節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenictechnology)：將外源基因?qū)爰?xì)胞，隨機整合到受體基因組內(nèi)，并隨細(xì)胞分裂而遺傳給后代。細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因植物?，F(xiàn)在是4頁\一共有70頁\編輯于星期五一.轉(zhuǎn)基因生物的意義20世紀(jì)80年代(BrinsterandPalmiter)：著名的轉(zhuǎn)基因小鼠實驗，金屬硫蛋白基因啟動子驅(qū)動大鼠生長激素基因表達(dá)。轉(zhuǎn)基因生物的用途：研究手段：疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型。改良動物性狀：抗病性、耐寒性等。生產(chǎn)產(chǎn)品：抗體、疫苗等的生產(chǎn)?，F(xiàn)在是5頁\一共有70頁\編輯于星期五現(xiàn)在是6頁\一共有70頁\編輯于星期五二、基本原理構(gòu)建攜帶目的基因的載體。外源基因?qū)耄簩⒛康幕蛲ㄟ^顯微注射等方法注入實驗動物的受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞中。使目的基因整合到基因組中。將此受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞再植入受體動物的輸卵管或子宮中。使其發(fā)育成攜帶外源基因的轉(zhuǎn)基因動物?，F(xiàn)在是7頁\一共有70頁\編輯于星期五基本原理供體基因受體的受精卵現(xiàn)在是8頁\一共有70頁\編輯于星期五基本原理轉(zhuǎn)基因的受精卵現(xiàn)在是9頁\一共有70頁\編輯于星期五基本原理轉(zhuǎn)基因動物現(xiàn)在是10頁\一共有70頁\編輯于星期五基本過程上游—基因改造和載體構(gòu)建中游—基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系下游—基因整合、表達(dá)的檢測與細(xì)胞篩選現(xiàn)在是11頁\一共有70頁\編輯于星期五1.上游—基因改造和載體構(gòu)建外源基因:完整的轉(zhuǎn)錄單位,由順式作用元件、結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄終止信號組成。報告基因(reportergene):在表達(dá)載體中引入易于檢測的提示重組體存在的基因。GFP、LacZ、AP、LUC。融合基因(fusiongene):將特定的目的基因與報告基因拼接成融合基因，并與順式作用元件拼接成完整的轉(zhuǎn)錄單位。現(xiàn)在是12頁\一共有70頁\編輯于星期五動物轉(zhuǎn)基因常用的載體腺病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體非病毒類載體：如質(zhì)粒等?，F(xiàn)在是13頁\一共有70頁\編輯于星期五2.中游—基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系基因?qū)爰夹g(shù)：物理、化學(xué)和生物學(xué)方法

1)顯微注射法（microinjection)2)胚胎干細(xì)胞法（embryonicstemcells,ES細(xì)胞）

3)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法

4)精子載體法現(xiàn)在是14頁\一共有70頁\編輯于星期五1)DNA顯微注射法制備超量受精卵。DNA顯微注射。轉(zhuǎn)移注射卵到輸卵管或子宮。轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定及鼠系建立?，F(xiàn)在是15頁\一共有70頁\編輯于星期五DNA顯微注射持卵管DNA注射針精原核卵原核現(xiàn)在是16頁\一共有70頁\編輯于星期五現(xiàn)在是17頁\一共有70頁\編輯于星期五DNA顯微注射DNA顯微注射到尚未發(fā)生核融合的受精卵的精原核。顯微鏡下觀察，精原核比卵原核大，容易辨別。線性DNA整合效率比超螺旋DNA高出數(shù)倍，因而用于顯微注射的轉(zhuǎn)入基因通常是去除載體序列的線狀DNA?，F(xiàn)在是18頁\一共有70頁\編輯于星期五DNA顯微注射法的特點DNA大小無限制，最大可達(dá)250Kb。隨機整合：在染色體上整合的位點是隨機的，整合的拷貝數(shù)也不一定。轉(zhuǎn)入的基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，干擾該基因的正常表達(dá)，影響轉(zhuǎn)基因動物的正常發(fā)育和代謝?？傂瘦^低(實際成功率1/1000)?，F(xiàn)在是19頁\一共有70頁\編輯于星期五提高顯微注射DNA表達(dá)的成功率轉(zhuǎn)入的外源基因要能夠高效表達(dá)，最好是可以誘導(dǎo)表達(dá)。轉(zhuǎn)入基因中應(yīng)該包含有幫助提高整合效率的序列，如微衛(wèi)星序列。微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星序列誘導(dǎo)表達(dá)啟動子外源基因現(xiàn)在是20頁\一共有70頁\編輯于星期五現(xiàn)在是21頁\一共有70頁\編輯于星期五2)胚胎干細(xì)胞法胚胎干細(xì)胞(embryostemcells,ES細(xì)胞)：可人工培養(yǎng)增殖的小鼠胚泡發(fā)育期胚胎細(xì)胞，當(dāng)把這種胚胎細(xì)胞重新導(dǎo)入另一胚泡期的胚胎之后，它仍然保持著分化成其他類型細(xì)胞的能力。ES細(xì)胞具有與胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征和分化特性?，F(xiàn)在是22頁\一共有70頁\編輯于星期五胚胎干細(xì)胞法分離和培養(yǎng)ES細(xì)胞。外源基因?qū)隕S細(xì)胞。導(dǎo)入外源基因的ES細(xì)胞的子宮轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定及鼠系建立?，F(xiàn)在是23頁\一共有70頁\編輯于星期五胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)胚泡培養(yǎng)皿中分離胚泡內(nèi)層細(xì)胞胰蛋白酶消化解離加飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞現(xiàn)在是24頁\一共有70頁\編輯于星期五胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)現(xiàn)在是25頁\一共有70頁\編輯于星期五胚胎干細(xì)胞外源DNA的導(dǎo)入DNA胚胎干細(xì)胞囊胚原囊胚轉(zhuǎn)基因動物磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法微注射現(xiàn)在是26頁\一共有70頁\編輯于星期五外源DNA的整合用于ES細(xì)胞的DNA載體一般帶有定點整合元件,避免了隨機整合。定點整合位點應(yīng)選擇在基因組內(nèi)編碼非必需產(chǎn)物的地方，以減少整合對細(xì)胞正常功能的影響。定點整合位點必須在基因組的可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的地方?，F(xiàn)在是27頁\一共有70頁\編輯于星期五胚胎干細(xì)胞法的特點定點整合。ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)，外源DNA導(dǎo)入后可用正-負(fù)選擇法篩選擇正確整合的ES細(xì)胞,相對較簡單。目前只在小鼠身上獲得成功?，F(xiàn)在是28頁\一共有70頁\編輯于星期五現(xiàn)在是29頁\一共有70頁\編輯于星期五3）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建獲得四/八細(xì)胞胚胎/囊胚/原腸胚外源DNA導(dǎo)入早期胚胎：獲得病毒顆粒感染早期胚胎包裝細(xì)胞與早期胚胎共培養(yǎng)感染后的胚胎植入受體動物子宮，發(fā)育成攜帶外源基因的動物?，F(xiàn)在是30頁\一共有70頁\編輯于星期五逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法外源基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒感染四/八細(xì)胞胚胎/囊胚/原腸胚嵌合小鼠純合體小鼠現(xiàn)在是31頁\一共有70頁\編輯于星期五逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的特點通過病毒DNA插入宿主DNA的機制，將外源目的基因整合到宿主基因組，整合效率高。反轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小片段DNA(＜10kb)。對家禽類的轉(zhuǎn)基因研究有重要意義?，F(xiàn)在是32頁\一共有70頁\編輯于星期五4）精子載體法外源DNA精子卵細(xì)胞受精卵轉(zhuǎn)基因動物共育法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法電穿孔法現(xiàn)在是33頁\一共有70頁\編輯于星期五DNA精子受精卵DNA卵細(xì)胞DNA胚胎干細(xì)胞DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒感染磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法四細(xì)胞胚胎囊胚原腸胚轉(zhuǎn)基因動物微注射顯微注射現(xiàn)在是34頁\一共有70頁\編輯于星期五3.下游—基因整合與表達(dá)檢測及篩選染色體基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位點和拷貝數(shù)。轉(zhuǎn)錄水平：轉(zhuǎn)基因的mRNA的存在與否以及表達(dá)水平。蛋白水平：轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)的表達(dá)以及功能檢測?，F(xiàn)在是35頁\一共有70頁\編輯于星期五鑒定方法PCRSouthernblot染色體原位雜交NorthernblotRT-PCRWesternblot現(xiàn)在是36頁\一共有70頁\編輯于星期五基因轉(zhuǎn)移鼠純合鼠系的建立×轉(zhuǎn)基因雜合鼠未轉(zhuǎn)基因鼠生殖系細(xì)胞中不含轉(zhuǎn)入基因生殖系細(xì)胞中含轉(zhuǎn)入基因子代多次交配可得到純合轉(zhuǎn)基因鼠系現(xiàn)在是37頁\一共有70頁\編輯于星期五三、轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用分析動物表型與外源基因的關(guān)系，揭示外源基因的功能。建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型。基因產(chǎn)品的制備：乳腺、膀胱生物反應(yīng)器。現(xiàn)在是38頁\一共有70頁\編輯于星期五人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型完整的動物模型可以模擬人類疾病的起始和發(fā)展，幫助了解疾病的病因和發(fā)展過程。為測試各種可能的治療方案提供一個統(tǒng)一有效的系統(tǒng)。轉(zhuǎn)基因動物模型提供了人類疾病的研究手段?，F(xiàn)在是39頁\一共有70頁\編輯于星期五人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型各種人類遺傳病的鼠模型，如：老年性癡呆癥(Alzheimer’sdisease)、關(guān)節(jié)炎(arthritis)、肌肉營養(yǎng)缺乏癥(musculardistrophy)、腫瘤發(fā)生(tumorigenesis)、高血壓(hypertension)、神經(jīng)退行性疾病(neurodegenenerativedisorder)、內(nèi)分泌功能障礙(endocrinological

disfunction)、動脈硬化癥及其他很多疾病?，F(xiàn)在是40頁\一共有70頁\編輯于星期五利用轉(zhuǎn)基因動物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白轉(zhuǎn)基因動物反應(yīng)器：乳腺、膀胱、血液生物反應(yīng)器等?？鼓窱II：轉(zhuǎn)基因綿羊的乳汁中。β乳球蛋白紅細(xì)胞生成素凝血因子VIII凝血因子IX生長激素現(xiàn)在是41頁\一共有70頁\編輯于星期五轉(zhuǎn)基因改良移植器官改造異種來源器官的遺傳性狀，使之適應(yīng)于人體器官或組織的移植。1997年起，利用遺傳改良的轉(zhuǎn)基因豬肝做為嚴(yán)重肝病患者的離體生命支持物。現(xiàn)在是42頁\一共有70頁\編輯于星期五動物的克隆1996年，首次實現(xiàn)動物的無性生殖。由綿羊的乳腺細(xì)胞提供細(xì)胞核，卵細(xì)胞提供細(xì)胞質(zhì)發(fā)育而來。核移植技術(shù)（NuclearTransfer)現(xiàn)在是43頁\一共有70頁\編輯于星期五核移植技術(shù)（NuclearTransfer)現(xiàn)在是44頁\一共有70頁\編輯于星期五現(xiàn)在是45頁\一共有70頁\編輯于星期五第二節(jié)基因打靶基因打靶(GeneTargeting)

：通過DNA定點同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究此基因的功能?；蚯贸?geneknockout):將某個基因定向去除?；蚯萌?geneknockin):定向?qū)⒁欢位蛐蛄刑娲硪欢位蛐蛄小，F(xiàn)在是46頁\一共有70頁\編輯于星期五一、基因打靶的基本程序打靶載體的構(gòu)建。打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞及其鑒定?；蚯贸鼸S細(xì)胞注射入胚泡。胚泡植入假孕小鼠的子宮。嵌合體的雜交建立基因打靶的純合鼠系?，F(xiàn)在是47頁\一共有70頁\編輯于星期五1.打靶載體的構(gòu)建同源基因片段質(zhì)粒載體HB1HB2neor基因HSV-tk基因現(xiàn)在是48頁\一共有70頁\編輯于星期五2.打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法顯微注射法現(xiàn)在是49頁\一共有70頁\編輯于星期五打靶載體的正-負(fù)選擇與整合位點兩端區(qū)域同源的兩段DNA序列(HB1和HB2)。目的基因。編碼抗G418的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neor基因）。2個不同的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2），分別來自I型II型單純皰疹病毒?，F(xiàn)在是50頁\一共有70頁\編輯于星期五打靶載體的正篩選

tk1HB1neorHB2tk2載體載體同源重組neorG418正篩選，細(xì)胞存活染色體染色體現(xiàn)在是51頁\一共有70頁\編輯于星期五打靶載體的負(fù)篩選

tk1HB1neorHB2tk2染色體染色體非特異性整合

GCV負(fù)篩選，細(xì)胞死亡現(xiàn)在是52頁\一共有70頁\編輯于星期五PCR鑒定在打靶載體的HB1和HB2之間，加上一個載體和鼠的基因組中都沒有的獨特DNA序列（US）。如發(fā)生隨機整合，PCR無法擴增出預(yù)期的DNA片段。如果整合于特定位點時，則PCR可以擴增出預(yù)期大小的片段?，F(xiàn)在是53頁\一共有70頁\編輯于星期五PCR鑒定：特異整合tk1HB1USneorHB2tk2P2P1PCR反應(yīng)有特異條帶特異整合現(xiàn)在是54頁\一共有70頁\編輯于星期五基因敲除小鼠的獲得基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮嵌合體的雜交育種：同源重組只發(fā)生在一條染色體上，因而同源重組后只能得到嵌合體，將嵌合體雜交，即可得到純合子。×現(xiàn)在是55頁\一共有70頁\編輯于星期五現(xiàn)在是56頁\一共有70頁\編輯于星期五基因敲除和RNA干擾基因敲除是在基因水平將某個基因定點去除，動物整體水平。RNA干擾不是敲除基因，而是誘導(dǎo)RNA的特異性降解，干擾基因的表達(dá)。一般是在細(xì)胞水平?，F(xiàn)在是57頁\一共有70頁\編輯于星期五第三節(jié)RNA干擾1990年，Jorgense等通過轉(zhuǎn)基因改造牽?；伾?。外源基因不但不能加深花的顏色，反而造成內(nèi)源基因表達(dá)的降低。

現(xiàn)在是58頁\一共有70頁\編輯于星期五RNA干擾是dsRNA導(dǎo)致的基因沉默1998年，F(xiàn)ire等在

C.elegans中用antisenseRNA抑制基因表達(dá)。dsRNA

比sense或antisenseRNA都好。注射甚至口服

dsRNA都能誘發(fā)基因沉默。很少量的雙鏈

RNA就能誘發(fā)C.elegans整體的基因沉默，甚至能傳遞到子一代。RNA干擾：RNAinterference(RNAi)

現(xiàn)在是59頁\一共有70頁\編輯于星期五RNAi是真核生物中廣泛存在的現(xiàn)象

植物：干擾因素自葉脈向外擴散，綠色熒光蛋白(GFP)基因被抑制，顯露出紅色。

線蟲：左側(cè)為

GFP轉(zhuǎn)基因線蟲；右側(cè)線蟲則經(jīng)

GFPdsRNA處理。部分細(xì)胞

RNAi相關(guān)蛋白表達(dá)較低，仍有綠色熒光。

Hela細(xì)胞：經(jīng)ORC6siRNA作用后，細(xì)胞出現(xiàn)多核現(xiàn)象。綠色為tubulin，紅色為DNA。ORC6細(xì)胞分裂調(diào)控蛋白。

果蠅：右側(cè)果蠅為野生型，左側(cè)為

shRNA

造成的色素缺乏的缺陷型?，F(xiàn)在是60頁\一共有70頁\編輯于星期五RNA干擾RNA干擾：雙鏈RNA誘導(dǎo)的同源mRNA降解。RNA干擾技術(shù)可以用于基因敲除，選擇性關(guān)閉特定細(xì)胞基因?，F(xiàn)在是61頁\一共有70頁\編輯于星期五siRNA的產(chǎn)生Dicer：RNaseIII的一種，可降解dsRNA成siRNA。ShortinterferingRNA(siRNA)：21~23nt現(xiàn)在是62頁\一共有70頁\編輯于星期五siRNA誘導(dǎo)同源序列的降解RNA-InducedSilencingComplex產(chǎn)生兩種后果：同源mRNA的降解。同源mRNA翻譯受阻?，F(xiàn)在是63頁\一共有70頁\編輯于星期五基因沉默的機制是多方面的dsRNA造成的mRNA降解。Post-translationalgenesilencingdsRNA造成同源性基因的甲基化和表達(dá)關(guān)閉。dsRNA造成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。dsRNA對蛋白質(zhì)的合成