β-catenin信號通路的調控作用,內科論文

百草枯致肺纖維化中Wnt/β-catenin信號通路的調控作用,內科論文[內容摘要]目的百草枯能夠導致肺纖維化發(fā)生發(fā)展，但其發(fā)生機制尚不明確。文中討論Wnt/-catenin信號通路在百草枯致肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用。方式方法SD雄性大鼠48只，隨機數字表法分為對照組和百草枯中毒組，每組24只。百草枯中毒組大鼠腹腔注射百草枯30mg/kg建立肺纖維化模型，對照組腹腔注射等量等滲鹽水。于百草枯中毒后14d和28d斷頸處死各組大鼠，剪取肺組織，HE染色和馬松染色檢測肺纖維化程度，Westernblot檢測Wnt/-catenin信號通路關鍵蛋白-catenin的表示出水平。培養(yǎng)人肺上皮細胞，實驗分為3組，空白對照組：不作任何處理；百草枯組：給予50mol/L的百草枯處理3d;抑制劑組：給予50mol/L的百草枯處理，同時給予Wnt/-catenin信號通路抑制劑DKK-120ng/mL處理3d.采用免疫熒光和Westernblot檢測Wnt/-catenin信號通路關鍵蛋白-catenin的表示出水平，qRT-PCR檢測肺上皮細胞標記E-Cadherin、Occludin和成纖維細胞標記蛋白-SMA、Vimentin表示出水平。結果大鼠百草枯中毒后，HE染色和馬松染色結果顯示，肺泡壁增厚，肺泡構造紊亂，膠原蛋白沉積，肺纖維化發(fā)生；Westernblot檢測結果表示清楚，與對照組大鼠相比，百草枯中毒組大鼠中毒14d-catenin的表示出水平顯著升高[〔0.380.04〕vs〔0.670.06〕,P0.01],中毒28d時高達〔1.050.08〕,升高更為明顯〔P0.01〕.與空白對照組相比，百草枯組E-Cadherin、Occludin表示出水平顯著下降〔P0.01〕,成纖維細胞標記-SMA、Vimentin表示出水平顯著升高〔P0.01〕;而百草枯組相比，抑制劑組-SMA和Vimentin表示出水平顯著下降，E-cadherin和Occludin的表示出水平顯著上升〔P0.01〕.結論百草枯染毒導致大鼠肺纖維化發(fā)生，并導致肺組織Wnt/-catenin信號通路激活，而阻斷Wnt/-catenin信號通路能夠抑制百草枯誘導的上皮-間質發(fā)生，證實Wnt/-catenin信號通路在百草枯致肺纖維化發(fā)生發(fā)展中起著重要的調控作用。[本文關鍵詞語]百草枯；肺纖維化；Wnt/-catenin信號通路；上皮-間質轉化。0引言。百草枯當前還是世界范圍內廣泛使用的有機雜環(huán)類除草劑。在我們國家，口服百草枯致死率可達60.0%~87.5%[1-2].百草枯中毒的主要的靶器官是肺，其特征性改變是肺損傷，早期表現為肺泡上皮細胞受損，炎癥浸潤，晚期則出現肺泡和肺間質的纖維化，患者最終死于呼吸衰竭[3-4].百草枯能夠導致肺組織內大量炎性因子和細胞因子表示出，激活相關信號通路，進而導致肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[5].有研究表示清楚：Wnt/-catenin信號通路在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展經過中起著重要的調控作用；高度激活的Wnt/-catenin信號通路能夠促進肺成纖維細胞、肺上皮細胞、干細胞轉分化為肌成纖維細胞〔Myofibro-blasts〕,促進膠原蛋白沉積，進而導致肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[6-8].Wnt/-catenin信號通路在百草枯導致的肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用并未見具體報道，本實驗討論Wnt/-catenin信號通路在百草枯致肺纖維化中的調控作用。1材料與方式方法。1.1實驗材料人肺上皮細胞〔16HBE〕購自中國科學院上海細胞庫。百草枯試劑〔美國Sigma公司〕,重組DKK1細胞因子〔美國PeproTech公司〕,-catenin和-actin抗體〔英國Abcam公司〕,熒光二抗AlexaFluor488〔美國LifeTechnologies公司〕.qRT-PCR試劑盒〔加拿大Fermentas公司〕.1.2實驗動物分組健康清潔級SD大鼠48只，體重180~220g,由我院比擬醫(yī)學科提供，實驗動物合格證號：CXK〔軍〕2007-2020.按標準飲食喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度〔212〕℃，濕度40%~70%,每日光照和黑暗各12h.隨機數字表法分為2組：百草枯中毒組：一次性腹腔注射百草枯溶液20mg/kg;對照組：一次性腹腔注射給予與百草枯中毒組等量的等滲鹽水，各24只。于百草枯中毒第14天和28天后處死各組大鼠，剪取肺組織，進行相關后續(xù)實驗。1.3肺組織HE染色及馬松染色各組大鼠肺組織剪取右下肺葉，4%多聚甲醛固定16h,經梯度脫水，石蠟包埋，做成4m厚度的切片，根據操作講明，切片進行HE染色和馬松染色，在100倍光鏡下觀察肺組織構造和膠原蛋白沉積情況。1.4人肺上皮細胞HBE的培養(yǎng)無菌條件下10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基〔參加1%L-谷氨酰胺，1%青鏈霉素〕培養(yǎng)HBE細胞，以1106個/mL的密度接種于100mm的細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)，每3天換液1次，直至細胞生長至80%融合。0.25%胰酶-EDTA消化細胞，以1∶3的比例傳代。1.5Westernblot法檢測Wnt/-catenin信號通路關鍵蛋白-catenin的表示出情況百草枯中毒組大鼠肺組織剪取左下肺葉，參加組織RIPA裂解液，研磨勻漿后，離心提取上清，Bradford檢測蛋白濃度，參加loadingbuffer溶液，存于-80℃。培養(yǎng)的HBE細胞分為3組，空白對照組：不作任何處理；百草枯組：給予50mol/L的百草枯處理3天；抑制劑組：給予50mol/L的百草枯處理，同時給予Wnt/-catenin信號通路抑制劑DKK-120ng/mL處理3d.提取各組細胞蛋白，Westernblot檢測-catenin蛋白表示出情況。每個樣本取等量蛋白進行SDS凝膠電泳，電壓100V,100min,電泳后，進行轉膜，電壓20V,時間10min.轉膜后，PBS清洗35min.取出膜，放于封閉液〔含3%脫脂奶粉和0.3%BSA〕中，37℃封閉2h.PBST〔含0.05%Tween20的PBS〕清洗1次，每次5min,將膜根據分子量裁成小條，加入多克隆兔抗-catenin和-actin抗體〔1∶3000〕,4℃孵育過夜后用適量PBST清洗65min.將膜又分別浸入1∶10000的帶HRP標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1h后用適量PBST清洗65min.ECL顯色。FluorChemFC2成像系統(tǒng)采集圖像，ImageJ軟件進行灰度值分析。1.6免疫熒光技術檢測HBE上皮細胞-catenin蛋白的表示出情況將空白對照組、百草枯組、抑制劑組細胞在預冷的4%多聚甲醛中固定10min,PBS清洗2次。0.1%Triton-X100進行10min的穿孔處理，PBS清洗2次。參加3%BSA37℃封閉1h.一抗〔-catenin〕4℃孵育過夜。PBS清洗3次，羊抗兔AlexaFluor488的二抗〔1∶200〕37℃孵育1h.PBS清洗6次，細胞核用DAPI〔5g/mL〕常溫下孵育6min,PBS清洗6次。90%甘油封固，激光共聚焦顯微鏡下拍照。1.7qRT-PCR技術檢測HBE上皮細胞標記E-Cadherin、Occludin和成纖維細胞標記-SMA、Vim-entin基因表示出水平采用TRIZOL提取法提取空白對照組、百草枯組、抑制劑組細胞RNA,進行逆轉錄后，RT-PCR試劑盒逆轉錄得到cDNA.取1L逆轉錄得到的cDNA進行qRT-PCR實驗，檢測E-Cadher-in、Occludin、-SMA和Vimentin基因的表示出水平。選擇18sRNA為內參基因，目的基因引物序列來自基因數據庫，引物序列為18sRNA正向：CTCCATCTTG-GCATCGCTGT;反向：GCTGTCGCCTTTACAGTTCC;E-Cadherin正向：GCGCTCCCCTCAGATGGTGTC;反向：ACGATGGCCGGCTTGTTGC;Occludin正向：GCT-CAGGGAATATCCACCTATCA;反向：CACAAAGTTT-TAACTTCCCAGACG;-SMA正向：GCATCCGACCTT-GCTAACG;反向：TCTCCAGAGTCCAGCACAATAC-CAG;Vimentin正向：ACATCCACCCGCACCTAC;反向：CAACTCCCTCATCTCCTCCTC.均由上海生工生物工程有限公司合成。融解曲線鑒定產物特異性，每個樣品重復測定3次。反響體系如下：2ABMix5L,10mol/L上下游引物各0.25L,cDNA1L,水3.5L.擴增條件為95℃預變性10min,95℃變性15s,60℃退火延伸60s,共40個循環(huán)。將對照組mRNA水平設為1.