DNA測序分析常見問題整理演示文稿

DNA測序分析常見問題整理演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有30頁\編輯于星期日測序結(jié)果—峰圖四色圖譜：每一種顏色對應(yīng)一種堿基ATCG現(xiàn)在是2頁\一共有30頁\編輯于星期日

引物DNA模板純化困難模板機(jī)器影響影響測序質(zhì)量的主要因素現(xiàn)在是3頁\一共有30頁\編輯于星期日一、引物對測序結(jié)果的影響①引物合成時(shí)多（少）一個(gè)堿基②引物不純③模板上沒有引物結(jié)合位點(diǎn)④引物二聚體⑤雙引物結(jié)合現(xiàn)在是4頁\一共有30頁\編輯于星期日合成時(shí)部分引物多一個(gè)堿基合成時(shí)部分引物少一個(gè)堿基●現(xiàn)象：每個(gè)峰后面有個(gè)同樣熒光信號(hào)的小“尾巴”?！裨颍汉铣蓵r(shí)引物多一個(gè)堿基?！駥Σ撸褐匦潞铣梢铩瘳F(xiàn)象：每個(gè)峰前面有個(gè)同樣熒光信號(hào)的小“尾巴”?！裨颍汉铣蓵r(shí)引物多一個(gè)堿基?！駥Σ撸褐匦潞铣梢铿F(xiàn)在是5頁\一共有30頁\編輯于星期日引物（模板）不純●現(xiàn)象：整個(gè)峰圖噪音都比較高。（區(qū)別與小片段的干擾）●原因：引物（模板）純度太低，含有較多雜質(zhì)●對策：–建議使用HPLC（柱子純化）或PAGE純化的測序引物。–脫鹽純化的引物純度較低，適合做普通PCR，但不建議用來測序?，F(xiàn)在是6頁\一共有30頁\編輯于星期日模板上沒有引物結(jié)合位點(diǎn)●現(xiàn)象：沒有特異性的測序峰圖●原因：引物無法結(jié)合模板●對策重新設(shè)計(jì)引物現(xiàn)在是7頁\一共有30頁\編輯于星期日引物二聚體●現(xiàn)象：前面100多bp噪音高，后面正常（引物二聚體片段小大在100bp左右）●原因：引物二聚體未去除干凈●對策：割膠純化現(xiàn)在是8頁\一共有30頁\編輯于星期日雙引物結(jié)合●現(xiàn)象：從一開始（區(qū)別于非單克?。┚统霈F(xiàn)兩套峰●原因：模板有兩個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)和兩個(gè)引物結(jié)合●對策：重新設(shè)計(jì)單個(gè)引物現(xiàn)在是9頁\一共有30頁\編輯于星期日二、模板對測序結(jié)果的影響①模板不純②點(diǎn)突變（SNP）③移碼突變④雜合子⑤非單克隆現(xiàn)在是10頁\一共有30頁\編輯于星期日噪音信號(hào)高終止峰PCR正常終止后面的噪音峰PCR正常終止正常模板與噪音現(xiàn)在是11頁\一共有30頁\編輯于星期日模板不純（非特異性PCR產(chǎn)物）●現(xiàn)象：每個(gè)峰下面都有其它顏色●原因：PCR主帶與雜帶混在一起測序●對策：凝膠電泳回收主帶，重新測序割膠純化現(xiàn)在是12頁\一共有30頁\編輯于星期日點(diǎn)突變（SNP）突變點(diǎn)如果模板有單核苷酸（堿基）突變（SNP），測序圖形中其他的位點(diǎn)一般都是單一的峰形，然后突然在某一個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)重疊峰(如圖中箭頭所示)?，F(xiàn)在是13頁\一共有30頁\編輯于星期日移碼突變在450bp處因點(diǎn)突變導(dǎo)致移碼，在528bp處又因點(diǎn)突變恢復(fù)現(xiàn)在是14頁\一共有30頁\編輯于星期日雜合子雜合變點(diǎn)雜合信號(hào)處的套峰強(qiáng)度大小相等，都相當(dāng)于正常峰值的一半。現(xiàn)在是15頁\一共有30頁\編輯于星期日非單克隆特征：左邊清晰，右邊全部像雜合子

原因：挑克隆時(shí)兩個(gè)質(zhì)粒混在一起對策：新挑克隆，重新制DNA現(xiàn)在是16頁\一共有30頁\編輯于星期日三、純化對測序結(jié)果的影響①染料峰②酒精峰③熒光物質(zhì)污染④釘子峰⑤有機(jī)物污染（瀑布效應(yīng)）現(xiàn)在是17頁\一共有30頁\編輯于星期日染料峰特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是殘余的A、T、C、G、4個(gè)BigDye峰，其不影響其它序列的可靠性?，F(xiàn)在是18頁\一共有30頁\編輯于星期日酒精峰特征：酒精峰位于序列的200bp-300bp堿基之間，圖譜被“透明”抬高，其同樣不影響其它序列的可靠性。現(xiàn)在是19頁\一共有30頁\編輯于星期日熒光物質(zhì)污染●現(xiàn)象：紅色峰異常高。●原因：未知大分子熒光物質(zhì)污染，恰好是紅色，被軟件誤認(rèn)為紅色峰?！駥Σ撸阂来胃鼡Q水、緩沖液、甲酰胺、測序膠、毛細(xì)管；清洗或更換膠引導(dǎo)塊、針筒。現(xiàn)在是20頁\一共有30頁\編輯于星期日“釘子”峰●現(xiàn)象：四色并存突然拔起的尖峰，峰形銳利?！裨颍好?xì)管內(nèi)有氣泡、灰塵、尿素結(jié)晶等，對激光全反射?！駥Σ擗C灌膠時(shí)，避免氣泡產(chǎn)生；–上樣前，樣品先離心；–毛細(xì)管、檢測窗口保持清潔；–膠內(nèi)有尿素結(jié)晶時(shí)，注意不要吸進(jìn)注射器；–樣品純化干凈?，F(xiàn)在是21頁\一共有30頁\編輯于星期日有機(jī)物污染（瀑布效應(yīng)）●現(xiàn)象：基線從高處突然下降。●原因：有機(jī)物進(jìn)入毛細(xì)管，受激發(fā)產(chǎn)生一定波長的熒光，抬高基線。●對策：依次更換水、緩沖液、甲酰胺、測序膠、毛細(xì)管；清洗或更換膠引導(dǎo)塊、針筒。現(xiàn)在是22頁\一共有30頁\編輯于星期日四、困難模板對測序結(jié)果的影響①特殊結(jié)構(gòu)②Ploy結(jié)構(gòu)③高GC④重復(fù)序列⑤回文結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是23頁\一共有30頁\編輯于星期日特殊結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是24頁\一共有30頁\編輯于星期日Poly結(jié)構(gòu)Poly在序列的前端對信號(hào)影響較小,Poly在序列的后端對信號(hào)影響較大。Poly-G/poly-C很容易導(dǎo)致信號(hào)中斷和信號(hào)亂?，F(xiàn)在是25頁\一共有30頁\編輯于星期日高GCPoly-G/poly-C是高GC的一種，很容易導(dǎo)致信號(hào)衰減。局部高GC一般會(huì)導(dǎo)致信號(hào)中斷和亂峰。現(xiàn)在是26頁\一共有30頁\編輯于星期日重復(fù)序列GT重復(fù)導(dǎo)致信號(hào)衰減A/G重復(fù)導(dǎo)致信號(hào)衰減或信號(hào)亂現(xiàn)在是27頁\一共有30頁\編輯于星期日回文結(jié)構(gòu)其他復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)導(dǎo)致衰