枸杞多糖對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響

枸杞多糖對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響

Summary：目的觀察枸杞多糖（Lyciumbarbarumpolysaccharide,LBP）對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻（unilateralureteralobstruction,UUO）大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響，并探討其拮抗纖維化的分子機(jī)制。方法將50只雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、LBP低劑量組、LBP中劑量組和LBP高劑量組，采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎的方法制備單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型，灌胃給藥，連續(xù)21d后處死大鼠，檢測(cè)其血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）的含量；用HE染色和Masson染色觀察大鼠腎臟組織病理改變；采用Westernblotting法檢測(cè)大鼠腎臟組織TGF-β1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清肌酐、尿素氮含量顯著升高（P<0.01），而中、高劑量枸杞多糖干預(yù)后的血清肌酐、尿素氮含量顯著下降（P<0.05）。模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟組織部分腎小管上皮細(xì)胞呈空泡狀，腎小管間質(zhì)變寬，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和腎間質(zhì)纖維化；而低、中、高劑量枸杞多糖干預(yù)后，上皮細(xì)胞變性萎縮、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及腎間質(zhì)纖維化面積均有顯著改善。與模型組比較，低、中、高劑量枸杞多糖干預(yù)組大鼠TGF-β1的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）。結(jié)論枸杞多糖具有拮抗腎間質(zhì)纖維化的作用，其延緩腎間質(zhì)纖維化機(jī)制可能通過下調(diào)TGF-β1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。Keys：枸杞多糖；TGF-β1；腎間質(zhì)纖維化；單側(cè)輸尿管梗阻EffectsofLyciumbarbarumpolysaccharideonrenalinterstitialfibrosisinratswithunilateralureteralobstructionTANGWeiwei,TANGTing,WANGLin,CHENLin,YUANQiuju,HURao,SUMin*(SchoolofBasicMedicalScience,ChangshaMedicalUniversity,HunanChangsha410219)Abstract:ObjectiveToobservetheeffectofLyciumbarbarumpolysaccharide(LBP)onrenalinterstitialfibrosisinratswithunilateralureteralobstruction(UUO),andtoexploreitsmolecularmechanismofantagonismoffibrosis.Method50maleratswererandomlypidedinto5groups:shamoperationgroup,modelgroup,lowdoseofLBP(LBP-L)group,mediumdoseofLBP(LBP-M)groupandhighdoseofLBP(LBP-H)group.UUOmodelwasestablishedbyunilateralureteralobstructionandgavagedintragastricallywithdrugfor21days.Theratsbloodsampleswerecollectedtodeterminetheureanitrogen(BUN)inserumandserumcreatinine(SCr).HistopathologicalchangesofkidneyinratswereobservedbyHEstainingandMassonstaining.

TheexpressionlevelofTGF-β1wasdetectedbywesternblotting.ResultsComparedwiththeshamoperationgroup,thelevelsofSCrandBUNinmodelgroupweresignificantlyincreased(P<0.01),whilethelevelsofSCrandBUNinLBP-MandLBP-Hweresignificantlydecreased(P<0.05).Thevacuolardegenerationofrenaltubularepithelialcellsintherenaltissueoftheobstructedsideofthemodelgroupwasobserved.WiththetreatmentofLBP-L,LBP-M,LBP-H,thedegreeofepithelialcelldegeneration,inflammatorycellinfiltrationandrenalinterstitialfibrosiswerealleviatedsignificantly.TheexpressionlevelofTGF-β1wassignificantlydecreasedcomparedwiththemodelgroup(P<0.01).ConclusionLBPhasanti-fibroticeffectonrenalinterstitial,anditsantagonisticmechanismmayberealizedthroughdecreasetheexpressionofTGF-β1inratskidney.Keywords:Lyciumbarbarumpolysaccharide;transforminggrowthfactor-β1;renalinterstitialfibrosis;unilateralureteralobstruction慢性腎臟疾?。╟hronickidneydisease,CKD）已經(jīng)成為危害全球公眾健康的常見疾病之一，可緩慢、進(jìn)行性發(fā)展為終末期腎臟疾?。╡ndstagerenaldisease,ESRD）[1]。CKD患者一旦進(jìn)展至ESRD，只能依賴透析或者腎臟移植來進(jìn)行治療，給社會(huì)和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國18歲以上成年人群中CKD的患病率為10.8%，而依此估算，我國現(xiàn)有超過1.2億的慢性腎臟疾病患者[2]，并且隨著高血壓、糖尿病、肥胖等患病人群的激增，在可預(yù)見范圍內(nèi)，我國慢性腎臟疾病的患病率也將顯著增加。腎間質(zhì)纖維化（renalinterstialfibrosis,RIF）是各種原因引起的慢性腎臟疾病進(jìn)展至ESRD的共同路徑和主要病理學(xué)表現(xiàn)[3]。因此遏制或者延緩腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生是逆轉(zhuǎn)腎功能衰竭的關(guān)鍵。枸杞子是茄科植物寧夏枸杞的干燥成熟果實(shí)，為原衛(wèi)生部公布的藥食兩用植物。枸杞子含有豐富的枸杞多糖（Lyciumbarbarumpolysaccharide,LBP）、?；撬帷ⅵ?氨基丁酸、植物甾醇等成分，并富含亮氨酸、纈氨酸等10余種氨基酸和胡蘿卜素、硫胺素、核黃素等多種維生素及礦物質(zhì)[4]。研究表明，枸杞多糖是枸杞子中的主要功能活性成分[5]。枸杞子，古藥書《本草匯言》載：“潤(rùn)肺生津，補(bǔ)腎填精?！薄妒朝煴静荨酚涊d：“枸杞堅(jiān)筋耐老，除風(fēng)，補(bǔ)益筋骨，能益人，去疲勞?！爆F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，LBP具有抗氧化延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫功能，保護(hù)生殖系統(tǒng)等生理功能[6]。研究還證實(shí)，LBP可改善糖尿病性雄性大鼠的生殖功能障礙，具有補(bǔ)腎生精，強(qiáng)精健體的功效[7-8]。但迄今為止，LBP對(duì)RIF的干預(yù)作用研究仍鮮有報(bào)道。本研究通過采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎的方法制造大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，以期觀察不同劑量枸杞多糖對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。1材料1.1動(dòng)物：雄性SD大鼠，SPF級(jí)，8周齡，體重180~220g，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境內(nèi)。1.2藥物與試劑：LBP（陜西力拓植物化工，純度50%），溶于生理鹽水，配成1g/L溶液；尿素氮（BUN）測(cè)定試劑盒、肌酐（Scr）測(cè)定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體由美國Abcam公司提供。2方法2.1造模和分組給藥：采用目前國際公認(rèn)的單側(cè)輸尿管結(jié)扎方法制備腎間質(zhì)纖維化大鼠單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）模型[9]。自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將50只SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、UUO模型組、LBP低劑量組、LBP中劑量組和LBP高劑量組，每組10只。大鼠給以10%水合氯醛（10mL/kg）行腹腔注射麻醉，麻醉后剔除左側(cè)背部毛，在背側(cè)無菌調(diào)節(jié)下打開大鼠腹腔，分離左側(cè)輸尿管，于中上1/3位置處結(jié)扎并剪斷，使大鼠左腎完全梗阻。而假手術(shù)組則于分離輸尿管后縫合腹部。假手術(shù)組和模型組每天給予5mg/kg0.9%生理鹽水灌胃，LBP高、中、低劑量組分別給予每天800mg/kg、600mg/kg、400mg/kgLBP灌胃。連續(xù)灌胃21d。

2.2血清肌酐和尿素氮的測(cè)定：藥物灌胃21d結(jié)束后，于大鼠眼眶靜脈叢取血，于室溫條件3000rpm/min離心10min，取上清。測(cè)定大鼠血清肌酐和尿素氮濃度，按照試劑盒說明書操作執(zhí)行。

2.3HE染色和Masson染色：給藥結(jié)束后，大鼠頸椎脫臼處死，快速剖取左腎，剝離包膜并用生理鹽水沖洗，沿腎長(zhǎng)軸橫切為二，一半腎臟組織于4%多聚甲醛溶液中固定保存，以完成HE、Masson染色以及免疫組織化學(xué)檢測(cè)，另一半分裝后置于液氮快速冷以進(jìn)行Westernblotting檢測(cè)。HE染色按照HE染色試劑盒中的操作說明進(jìn)行染色處理，將石蠟切片經(jīng)過二甲苯溶液脫蠟處理，經(jīng)過不同濃度的酒精溶液進(jìn)行水化處理，經(jīng)過蘇木素染色、返藍(lán)液返藍(lán)、伊紅染色、脫水、透明化等處理后進(jìn)行封片，于光學(xué)顯微鏡中觀察腎臟組織病理學(xué)變化。Masson染色具體操作步驟參照Masson染色試劑盒，常規(guī)脫蠟至水，用Weigert鐵蘇木素染色液染色10min，酸性乙醇分化液分化15s，Masson藍(lán)化液返藍(lán)5min，蒸餾水沖洗1min，麗春紅品紅染液染色10min，依次用弱酸工作液、磷鉬酸溶液清洗，放入苯胺藍(lán)染液中染色2min，經(jīng)弱酸工作液沖洗、乙醇脫水、二甲苯透明處理后用中性樹膠封固，于光學(xué)顯微鏡下觀察，并根據(jù)腎間質(zhì)纖維化面積與所選視野總面積之比計(jì)算大鼠腎臟組織纖維化面積比。

2.4Westernblotting檢測(cè)大鼠腎臟組織TGF-β1蛋白質(zhì)的表達(dá)：提取大鼠腎臟組織總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒定量檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。取等量的蛋白質(zhì)溶液上樣并進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)束后去除濃縮膠取分離膠。PVDF膜先用無水乙醇浸潤(rùn)，后用轉(zhuǎn)膜緩沖液漂洗備用。轉(zhuǎn)膜“三明治”模型按照負(fù)極（黑色）→三層濾紙→SDS分離膠→PVDF膜→三層濾紙→正極（紅色）組裝好，在低溫恒流200mA的條件下電泳30~60min，電泳完畢后標(biāo)記PVDF膜正反面。轉(zhuǎn)膜完畢后，用含5%脫脂奶粉的TBS溶液室溫封閉2h后，與兔抗大鼠TGF-β1抗體（1:2000），4℃孵育過夜。一抗孵育完后，用TBST緩沖液漂洗3次以上，每次10分鐘以上，以徹底去除未結(jié)合的一抗。再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗工作液（1:5000）雜交，室溫孵育1h。TBST再次漂洗后用ECL試劑顯色并曝光成像，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行定量分析，利用圖像分析系統(tǒng)掃描確定X光片上雜交條帶的A值。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用GraphPadPrism9.4.0進(jìn)行單因素方差分析（One-WayANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果與分析3.1枸杞多糖對(duì)UUO大鼠血清尿素氮和肌酐的影響如圖1A，1B所示，與假手術(shù)組對(duì)比，單側(cè)輸尿管梗阻模型大鼠血清肌酐和尿素氮的含量均有顯著升高，且差異顯著（P<0.01）。與模型組大鼠比較，中劑量和高劑量LBP組大鼠血清肌酐的含量均有顯著下降（差異分別為P<0.05，P<0.01），而低劑量LBP組大鼠血清肌酐含量和UUO組比較無顯著差異。而BUN含量變化，如圖1B所示，低、中、高劑量LBP干預(yù)組與UUO組比較均有顯著下降，低劑量組差異P<0.05，而中、高劑量組差異P<0.01。A

B注：與假手術(shù)組（Control）比較，##=P<0.01；與模型組（UUO）比較，*=P<0.05，**=P<0.01；LBP-L：LBP低劑量組；LBP-M：LBP中劑量組；LBP-H：LBP高劑量組圖1枸杞多糖（LBP）對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）大鼠血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）含量的影響Figure1EffectsofLyciumbarbarumpolysaccharideoncreatinineandureanitrogeninserumofunilateralureteralobstruction(UUO)rats3.2枸杞多糖對(duì)UUO大鼠腎臟病理形態(tài)的影響HE染色可見假手術(shù)組腎臟組織皮、髓質(zhì)分界清楚，腎小球、腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常病變，腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而UUO模型組可見大量腎小管上皮細(xì)胞壞死，未壞死腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫變性，或胞質(zhì)呈空泡狀。腎小管間質(zhì)增寬，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)伴纖維細(xì)胞增生。與UUO模型組比較，LBP各劑量組腎小管病變、腎間質(zhì)增寬均有不同程度的減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)減少。Masson染色假手術(shù)組腎小管上皮細(xì)胞略呈低柱狀，細(xì)胞界限不規(guī)則，核圓形，位于細(xì)胞基底部，基底膜完整光滑，胞質(zhì)中有大量線粒體，呈桿狀，嵴密集，細(xì)胞游離面有許多微絨毛，胞質(zhì)中有溶酶體；間質(zhì)體積無擴(kuò)張，內(nèi)容物較少。UUO組腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，細(xì)胞膜消失，基底膜斷裂不完整，核膜皺縮，溶酶體數(shù)量增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體嵴擴(kuò)張或消失，部分管腔內(nèi)可見細(xì)胞碎片；間質(zhì)體積擴(kuò)張，內(nèi)有大量細(xì)胞外基質(zhì)成分和成纖維細(xì)胞。與UUO模型組比較，LBP各劑量組大鼠腎小管上皮細(xì)胞變性，腎間質(zhì)纖維化面積均得到不同程度的顯著改善（均為P<0.05），如下表1所示。組別劑量/mg·kg-1腎間質(zhì)纖維化面積/%Control組—23.92±4.03UUO組—85.87±14.48aLBP-L40071.92±12.95abLBP-M60060.01±11.94abLBP-H80030.34±5.80ab注：與假手術(shù)組（Control）比較，a=P<0.05；與模型組（UUO）比較，b=P<0.05；LBP-L：LBP低劑量組；LBP-M：LBP中劑量組；LBP-H：LBP高劑量組表1各組大鼠腎間質(zhì)纖維化面積比Table1Arearatioofrenalinterstitialfibrosisinratsineachgroups3.3枸杞多糖對(duì)UUO大鼠腎臟組織TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

如圖2A，2B所示，Westernblotting結(jié)果顯示單側(cè)輸尿管梗阻模型組大鼠腎臟組織TGF-β1的表達(dá)顯著高于假手術(shù)組（P<0.05）。LBP-L、LBP-M、LBP-H干預(yù)組大鼠腎臟組織TGF-β1蛋白的表達(dá)量均顯著低于UUO組（P<0.01），且LBP-H與LBP-L，LBP-M治療組比較，TGF-β1的蛋白表達(dá)水平均有顯著減少，差異分別為P<0.01，P<0.05，呈現(xiàn)劑量依賴性。AB注：與假手術(shù)組（Control）比較，##=P<0.01；與模型組（UUO）比較，**=P<0.01；

LBP-L：LBP低劑量組；LBP-M：LBP中劑量組；LBP-H：LBP高劑量組圖2Westernblotting檢測(cè)各組大鼠腎臟組織TGF-β1的表達(dá)Figure2WesternblottingtodetecttheexpressionofTGF-β1inkidneysofratsineachgroups4討論腎間質(zhì)纖維化是多種臨床和實(shí)驗(yàn)性腎病進(jìn)展的共同轉(zhuǎn)歸，是腎功能衰竭的主要病理基礎(chǔ)。其病理學(xué)改變主要有間質(zhì)膠原、纖連蛋白（FN）等細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellularmatrix,ECM）在腎間質(zhì)沉積，導(dǎo)致腎間質(zhì)面積增寬，腎間質(zhì)纖維化，正常的腎形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，腎功能逐漸衰退。單側(cè)輸尿管梗阻模型是目前公認(rèn)的研究腎間質(zhì)纖維化的經(jīng)典模型，本研究通過單側(cè)輸尿管結(jié)扎的方法建立單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）大鼠模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，UUO組大鼠的血清肌酐和尿素氮水平均有顯著升高，且病理學(xué)結(jié)果顯示梗阻后的大鼠腎臟組織中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管擴(kuò)張、壞死、腎間質(zhì)面積增寬以及腎間質(zhì)纖維化，提示UUO模型造模成功。腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制目前尚未被完全闡明，但各種致纖維化的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子被認(rèn)為在促纖維化過程中發(fā)揮重要作用。其中TGF-β1是目前公認(rèn)作用最強(qiáng)的致纖維化細(xì)胞因子之一，其過表達(dá)可導(dǎo)致腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化[10]。本實(shí)驗(yàn)中，單側(cè)輸尿管梗阻的模型組大鼠TGF-β1的蛋白表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在模型組大鼠中，腎間質(zhì)纖維化面積較假手術(shù)組相比也有顯著增加，證實(shí)TGF-β1在大鼠腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程中起著重要作用。枸杞子在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中已證實(shí)有著補(bǔ)腎生精，強(qiáng)勁健體的療效。枸杞多糖是從枸杞子中分離出的主要水溶性多糖之一，是枸杞子的主要功能活性成分。枸杞多糖對(duì)腎臟的保護(hù)作用是否通過拮抗腎間質(zhì)纖維化而實(shí)現(xiàn)，其有無拮抗RIF的作用及其具體的分子機(jī)制都尚不明確。本研究結(jié)果顯示，低劑量、中劑量、高劑量枸杞多糖干預(yù)組大鼠的梗阻腎臟組織中TGF-β1的蛋白表達(dá)均較模型組顯著下調(diào)；中劑量、高劑量枸杞多糖干預(yù)組大鼠血清的肌酐和尿素氮的含量較模型組均顯著減少，而低劑量枸杞多糖干預(yù)組大鼠血清肌酐含量較模型組無顯著差異；腎間質(zhì)纖維化的組織學(xué)改變較模型組顯著減輕。由此推測(cè)，枸杞多糖能夠通過抑制促纖維化細(xì)胞因子TGF-β1的表達(dá)來減輕腎臟組織的病理損害，具有改善和延緩腎間質(zhì)纖維化病變的作用；而在不同劑量的枸杞多糖作用對(duì)比中，我們發(fā)現(xiàn)，高劑量組的拮抗效果優(yōu)于低、中劑量組。綜上所述，枸杞多糖能夠有效防治UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化，抑制TGF-β1的表達(dá)是其可能的主要作用路徑。枸杞多糖對(duì)TGF-β1下游信號(hào)通路的調(diào)控仍需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在后續(xù)的研究中，我們將繼續(xù)完善枸杞多糖對(duì)經(jīng)典的TGF-β/Smad信號(hào)通路的干預(yù)效應(yīng)研究，并探討枸杞多糖單藥或和其他中藥配伍的最佳劑量，為推動(dòng)基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化提供更多的參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而最大限度地發(fā)揮傳統(tǒng)中藥優(yōu)勢(shì)。Reference：[1]ANDRIKOPOULOSP，KIESWICHJ，PACHECOS，etal.TheMEKinhibitortrametinibameliorateskidneyfibrosisbysuppressingERK1/2andmTORC1signaling[J].JournaloftheAmericanSocietyofNephrology：JASN，2019，30（1）：33-49.[2]吳君,荊雪寧,沈偉,等.五苓散通過TGF-β1/Smad通路抗大鼠腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2022(033-005).[3]HYSIE，HEXL，F(xiàn)ADHELMN，etal.Photoacousticimagingofkidneyfibrosisforassessingpretransplantorganquality[J].JCIInsight，2020，5（10）：e136995.[4]田代華.實(shí)用中藥辭典（下卷）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002:1348-1351.[5]朱彩平,張民,張聲華.枸杞多糖的組成及結(jié)構(gòu)分析[J].中草藥,2006,37(6):872-874.[6]郭敏,烏蘭托雅,李剛.枸杞多糖藥理作用的研究進(jìn)展[J].華西藥學(xué)雜志,20