基因工程重組人干擾素概述

根據(jù)來(lái)源、基因序列和氨基酸組成分類

I型干擾素：ＩFNα、IＦNβ、ＩFNτ、IFＮω來(lái)源：白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、病毒感染的組織細(xì)胞等功能：抗病毒感染、抗腫瘤生長(zhǎng)

免疫調(diào)節(jié)〔較弱)

其中IＦN-α為多基因產(chǎn)物,有２３種以上的亞型。ＩI型干擾素：干擾素γ(ＩFN)來(lái)源：活化的Ｔ細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生功能：免疫調(diào)節(jié)提高單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原提呈能力增強(qiáng)Tc細(xì)胞和ＮK細(xì)胞的殺傷活性抑制TH２細(xì)胞形成,下調(diào)體液免疫應(yīng)答趨化作用抗病毒和抗腫瘤作用〔次要)２.根據(jù)動(dòng)物來(lái)源確定分類,例如人干擾素〔HｕIFN)，小鼠干擾素(MuＩFN)。免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在對(duì)宿主免疫細(xì)胞活性的影響,如對(duì)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、Ｂ細(xì)胞和NK細(xì)胞等均有一定作用。對(duì)巨噬細(xì)胞的作用：IＦＮγ可使巨噬細(xì)胞外表ＭHCⅡ類分子的表達(dá)增加,增強(qiáng)其抗原遞呈能力；此外還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞外表表達(dá)Fc受體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬免疫復(fù)合物、抗體包被的病原體和腫瘤細(xì)胞。對(duì)淋巴細(xì)胞的作用：干擾素對(duì)淋巴細(xì)胞的作用較為復(fù)雜，可受劑量和時(shí)間等因素的影響而產(chǎn)生不同的效應(yīng)。在抗原致敏之前使用大劑量干擾素或?qū)⒏蓴_素與抗原同時(shí)投入會(huì)產(chǎn)生明顯的免疫抑制作用；而低劑量干擾素或在抗原致敏之后參加干擾素那么能產(chǎn)生免疫增強(qiáng)的效果。在適宜的條件下，IFNγ對(duì)B細(xì)胞和CD８+T細(xì)胞的分化有促進(jìn)作用,但不能促進(jìn)其增殖。ＩＦNγ能增強(qiáng)ＴH１細(xì)胞的活性,增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能；但對(duì)TH２細(xì)胞的增殖有抑制作用,因此抑制體液免疫功能。IFNγ不僅抑制TH２細(xì)胞產(chǎn)生IL－４,而且抑制IL-４對(duì)Ｂ細(xì)胞的作用,特別是抑制B細(xì)胞生成IgＥ。對(duì)其它細(xì)胞的作用：IFＮγ對(duì)其他細(xì)胞也有廣泛影響：①刺激中性粒細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬能力；②活化NK細(xì)胞,增強(qiáng)其細(xì)胞毒作用；③使某些正常不表達(dá)MＨCⅡ類分子的細(xì)胞〔如血管內(nèi)皮細(xì)胞、某些上皮細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞)表達(dá)MHCⅡ類分子,發(fā)揮抗原遞呈作用；④使靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)中性粒細(xì)胞的粘附能力更強(qiáng)，且可分化為高內(nèi)皮靜脈,吸引循環(huán)的淋巴細(xì)胞。二重組干擾素的臨床應(yīng)用廣譜抗病毒活性(rｈuＩFNα〕慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。直接抗腫瘤活性(rｈｕIＦNα〕毛細(xì)胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫調(diào)節(jié)活性——治療慢性肉芽腫瘤〔ｒhuIＦNγ)多發(fā)性硬化癥rhuＩFNβ對(duì)基因序列的干擾素,基因文庫(kù)的調(diào)用可以用其序列３＇端和５'端局部事先用同位素?標(biāo)記過(guò)的序列作為探針，通過(guò)雜交的方法進(jìn)展調(diào)用。由于干擾素基因的種屬特異性不是很大,|可以用人的干擾素基因?yàn)橥刺结?從鼠基因文庫(kù)中調(diào)出相應(yīng)的干擾素基因,其方法將在下文１中提到。｜

對(duì)于擾素基因的取用,不僅可以使用構(gòu)建基因文庫(kù)的方法，對(duì)已了解其氨基酸或核昔酸割

成的干擾素也可以用化學(xué)合成的方法先合成其編碼的DNA序列,再對(duì)其進(jìn)展表達(dá)?；瘜W(xué)合｜成方法包括固相合成法及液相合成法兩大類。與利用基因文庫(kù)的方法相比,化學(xué)合成法比較|復(fù)雜，由于每參加一個(gè)核昔酸就會(huì)有一定比例的錯(cuò)誤摻入、基因重疊、基因缺失等情況,并且在ｌ整個(gè)合成過(guò)程中這種錯(cuò)誤不斷積累，因此該方法適合比較短的基因,而對(duì)長(zhǎng)的基因那么有目的產(chǎn)|物含量低、產(chǎn)物純化困難的缺點(diǎn)。但它也有優(yōu)點(diǎn),如可根據(jù)研究的需要對(duì)一些氨基酸進(jìn)展定點(diǎn)|突變,或根據(jù)宿主菌的特性，在不改變其氨基酸組成的情況下使用宿主的偏愛(ài)密碼子,以提高|產(chǎn)物的產(chǎn)量。|?對(duì)于不同亞型的干擾素,由于同源性較高,可以用一樣的引物從誘導(dǎo)的小鼠細(xì)胞系中提取?mＲＮA混合物進(jìn)展反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增,然后用亞型特異性探針對(duì)CDNA混合物進(jìn)展Ｓoutheｒn印跡,這樣便可將序列上相差較小的同種、不同亞型的干擾素基因進(jìn)展別離,為生產(chǎn)高純度的單一干擾素提供了方法Ｏ?三、表達(dá)方法?隨著對(duì)干擾素研究的深入,人們了解到鼠干擾素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上的

１０～４０位、７８～１０７位、１２３～１６６位的Ａ、B、C區(qū)，尤其是位于７８和７９位的氨基酸對(duì)抗病毒|活性十分重要。而人IFNt１的１２１～１３６位對(duì)抗病毒活性作用較大,人ＩFＮ子的N端１０個(gè)集|基酸也是保持其活性所必需的。對(duì)干擾素構(gòu)造的了解為更好地構(gòu)建基因表達(dá)奠定了根底。干|擾素最初是用其外源序列進(jìn)展表達(dá)的，但近年來(lái)的研究說(shuō)明嵌合表達(dá)的干擾素往往優(yōu)于單一

干擾素,因此出現(xiàn)了較多的嵌合表達(dá)形式,并取得了較好的效果。?１.ＩFN-α的表達(dá)家蠶作為一種用于表達(dá)外源基因的宿主有易于養(yǎng)殖、生產(chǎn)周期短、夕陽(yáng)基因表達(dá)量高的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)由于家蠶為真核生物,能對(duì)表達(dá)產(chǎn)物自行進(jìn)展糖基化修飾,產(chǎn)生有生物活性的蛋白，并且在產(chǎn)物提取的過(guò)程中只要將家蠶進(jìn)展勻漿,再進(jìn)展抽提即可，操作上十分方便，因此,它在基因工程領(lǐng)域內(nèi)被廣泛應(yīng)用。下面便以人IＦN,α的生產(chǎn)為例介紹家蠶表達(dá)體系在干擾素生產(chǎn)中的應(yīng)用。

用家蠶核型多角病毒BIIＩNPV體外感染的家蠶傳代細(xì)胞株BＭ-N通過(guò)噬菌斑法純化得到BmNPＶ的τ３亞型。利用從感染脂肪體mRＮＡ制得的CDＮA為探針，對(duì)其多角蛋白序列進(jìn)展檢驗(yàn)，其中１０．５ｋb的EcｏRＩ片段及３.９?fàn)N的ＨｉndE片段可與探針雜交,將１０.５燦的EcｏRI片段克隆到pＢR３２２中,產(chǎn)生質(zhì)粒pBｍE３６０對(duì)其用HｉndＥ切，得到３.９ｋb片段，其中|含有多角蛋白全部序列(圖１２３中為黑色框架),將該片段插入pＵC９的HinｄE位點(diǎn),產(chǎn)生質(zhì)|粒p９H１８。將ｐ９H１８用EｃｏＲI切后于５０UＢAＬ３１外切核酸酶緩沖液中２３℃水?。保癿iｎ,更|掐鍾油油菲如ｎ入０７倍他烈的。氣mｎlAｄEDＴA終止反響。將截短的p９H１８片段用HindEi切,并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳別離２.７kｂ的Hｉnd皿平頭末端片段,將其插入pUC９即ｐ９B３１０?的HiｎｄHＩ-ＳｍaＩ位點(diǎn)O另外,將pBmE３６的３.１峙的HinｄE片段連接到ｐＵC８上，得到質(zhì)粒ｐ８H２２５，用EcｏRI及AatＥ切,得含有多角蛋白基因下游３.１kb基因的３．５kb片段,將其連接到p９H１８的４.７kb的ＥcoRIAaｔE片段上，產(chǎn)生雜交質(zhì)粒ｐ８９B３１０,它在啟動(dòng)子下游含有多聚接頭〔EcｏＲI、BaｍＨＩＳｍaI、SalＩ、ＰstI位點(diǎn)〕。將從基因文庫(kù)中用１８３bp探針調(diào)出的在AＴG后含有SmaＩ位點(diǎn)〔即有序列ＣＣCＧＧGATＧ)的IFNｍαＪ基因片段連接到p８９B３１０上，便構(gòu)建成質(zhì)粒pIＦN２Ｂ３１０。將pＩFＮ２B３１０與病毒基因組DNＡ便可共轉(zhuǎn)染ＢM-N細(xì)胞系或家蠶幼體,其具體操作如下：向２．５mＬ含有０.２５mｏlACaＣl２、１０μgＢｍＮPVＤNA及６５μｇｐIFN２Ｂ３１０的溶液中加含０.２８II１０１４NaCl、０．７mｍoi/ＬＮａ２C０３、０．７IIIＩI１０１４Na２HP０４、５０mｍol/LEfＥPＥ(pH７.１〕的緩沖液，進(jìn)展沉淀。?。?４５mｌ沉淀加至４.５ｍi含３×１０６個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)液中,１２ｈ后換液一次，再培養(yǎng)４d,即可得到重組病毒ＢmIＦN２Ｂ３１０。用?兩個(gè)噬菌斑單位的病毒感染３×１０６個(gè)BM－N細(xì)胞或用５０μＬ３×１０５個(gè)噬菌斑單位的病毒溶液注人家蠶幼體,培養(yǎng)２４h后收集培養(yǎng)液便可得到干擾素。?２.IFN-目的表達(dá)將人IＦN-R基因HiｍdＥ片段插人載體ｐSV２-dｈfr中SＶ４０晚期啟動(dòng)子PL下游的PｖuE位點(diǎn)。用此重組質(zhì)粒與帶有黃瞟嶺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(XGＰRＴ)基因的質(zhì)粒pSU－-gｐt共轉(zhuǎn)染次黃瞟嶺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶〔HGＰRＴ)基因缺陷小鼠的骨髓瘤(sp２４)細(xì)胞Ｏ經(jīng)過(guò)霉盼酸及氨基喋嶺培養(yǎng)基篩選，便可得到表達(dá)人IFN-R。具體操作步驟如下：將含有人IFN-?p基因的重組質(zhì)粒ｐB(yǎng)V－９２用EcoRI及HｉndE酶切,分別作為探針模板及插入片段，同時(shí)用PvuII切載體pSVZdhfｒ質(zhì)粒,使其線性化后將外源基因插入。將次黃瞟嶺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因缺陷的sｐ２／０細(xì)胞在含有１０％小牛血清、１０%青鏈霉素的ＤLｆEM培養(yǎng)基中傳３～４代后在小空斑瓶中培養(yǎng)２４h,成半懸浮狀，４００r/勺１in離心５mｉn將細(xì)胞沉積參加新鮮培養(yǎng)基,再培養(yǎng)２～４h。轉(zhuǎn)染液中含目的基因pSVHIＦ和標(biāo)記基因pＳVZgpt(比值為１０：１),其中ＤNA濃度為２０μg/IＩIｌo在２ＩIIol/LCaCl２６３陣、１０mmolAＴｒis－HＣl(pH７．１)４２８μＬ中緩緩參加２×HeBs液(EEPES５０ｍmol只L、NaCl２８０ｍmｏlA、Na２ＨP０４０．７５mmolA、０．７５IIlII１０１４Na２ＨP０４,pH７.１)約５００μＬ,參加sｐ２/０細(xì)胞培養(yǎng)物中,輕輕搖勻３７℃孵育８h。再更換為含有黃瞟嶺２５０μg/mＬ、次黃瞟嶺１５μg/ｍL、胸昔１０μｇ/mL、氨基蝶嶺。－２μg／mＬ、霉盼酸２５問(wèn)／mL的ＤｈEM培養(yǎng)基，３７℃cq孵箱中選擇性培養(yǎng)。一周后更換為含２５０μg/mL黃瞟嶺的D；舊M培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)２周以上,檢查IＦＮ－P活性。

３.ＩFN－γ的表達(dá)以鼠干擾素ＭｕＩFＮ-γ為例(圖１２-３)。用含人IＦN-γ編碼區(qū)基因的探針與噬菌體γMG９構(gòu)建的鼠Ｍ６００基因組DＮA文庫(kù)在２０%甲酷膠中進(jìn)展低嚴(yán)格性的雜交，膜用０．３molANaＣl、０．０３II１０１４擰棱酸納及０.１％NaEbS０４在室溫洗滌兩次。將結(jié)合的噬

菌體用噬菌斑法純化,提取DNA后,用多種限制性內(nèi)切酶切,以１%葡聚糖凝膠電泳純化后與人ＣDNＡ探針雜交,將γMG９中與探針可以雜交的１０.５kb的BaｍHI片段亞克隆到pＢR３２２的BaIIＩＨI位點(diǎn),產(chǎn)生質(zhì)粒pMＧ１０.５。通過(guò)電泳分出插入片段大于６０００坤,即含有完整MuＩＦN-Y的質(zhì)粒,用PｖｕＩI酶切,六個(gè)切點(diǎn)中有一個(gè)位于５＇端非編碼區(qū),取從此切點(diǎn)到第一內(nèi)元中ClａI的３４８bp的片段以及用ClaI及BglH酶切得的ＭuＩFNmγ３F端片段Ｏ將載體質(zhì)粒ｐ３４２E用EcｏＲＩ及BamＨI酶切，并用聚合酶Ｉ將ＥcｏRI切點(diǎn)補(bǔ)成平頭末端,與以上制得的兩個(gè)片段混合，一同轉(zhuǎn)化大腸桿菌２９４,選出ＡＩIIP抗性菌株,從中提取質(zhì)粒即為含有干擾素編碼基因的ｐSＶEＩＩ１１１γ。用外表活性劑右旋糖所活化COEL１細(xì)胞,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入并培養(yǎng)４８ｈ后離心，上清液中便含有干擾素。

４．嵌合干擾素的表達(dá)嵌合干擾素大致可以分為兩種類型：一種是兩種不同類型或同類型而不同亞型的干擾素間進(jìn)展嵌合,另一種是干擾素或其局部序列與其他活性物質(zhì),如抗體、白介素等進(jìn)展嵌合,以便得到新的生物活性產(chǎn)物。下面就這兩種情況分別舉例介紹。?將從基因文庫(kù)中調(diào)出的編碼淋巴細(xì)胞干擾素B和D的CDNA連接到大腸桿菌色氨酸啟動(dòng)子、操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及起始密碼子ATＧ后面,分別構(gòu)成表達(dá)載體pLＹＥN－B和ＰＬy-IFN－Ｄ。為構(gòu)建嵌合干擾素,可先將親代干擾素的編碼序列在一樣位點(diǎn)Ｓ１(Sａ１１３AI)、Ｐv〔PVU

Ｅ)、Ｓ２(Sa１１３AI)切斷,產(chǎn)生含有氨基端１～６０、１～９２、６１～９２、９３～１５０、９３～１６６、１５１～１６６位氨基酸的片段,用６%的聚丙烯釀膠凝膠電泳別離(圖１２４)。將適宜的片段連接，得到嵌合?DNA,將含有嵌合ＤＮA的質(zhì)粒用ＨindE和PsｔＩ切后將酶切片段連接到pＢR３２２的ＨｉｎdＥmpsｔI位點(diǎn)上,將得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中,同時(shí)對(duì)DNA序列進(jìn)展測(cè)定。含有轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的大腸桿菌HT－２在M９培養(yǎng)基中培養(yǎng)到OD６５０為５～８時(shí),離心得到細(xì)胞,并用含１００mｍｏIA

Ｔris－ＨＣ１、０.５ｍolＡＮaＣｌ、５mmｏlAEDTA及０．１ＩIIEｎoｌ/LPMSF的pH為８．０的緩沖液重新溶解之。在０℃參加１mg/ｍl溶菌酶,細(xì)胞在溶菌液中裂解。離心后將上清用單克隆抗體親和層析柱純化兩次,將純化后的活性干擾素溶于ＰBS后利用超濾膜ＹM(fèi)１０濃縮至１～３時(shí),再將濃度調(diào)整到０.１／?IIIgｍlo利用SDS聚丙烯酷膠電泳對(duì)于擾素的純度進(jìn)展測(cè)定。

IFN-γ及ＴNＦ-R基因已經(jīng)分別被克隆,并用工程菌加以表達(dá)。對(duì)其序列的研究說(shuō)明，IFN-R在竣基端的１３個(gè)氨基酸以及TＮF-下在氨基端的２３個(gè)氨基酸均對(duì)它們的生物活性沒(méi)有影響,因此在設(shè)計(jì)構(gòu)建ＩFN-γ與TNER嵌合物時(shí)可以將其去除,利用色氨酸啟動(dòng)子構(gòu)建的含有IFＮEγ氨基端１３４個(gè)氨基酸及TNF-Ｐ竣基端１４８?jìng)€(gè)氨基酸的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)造見(jiàn)圖１２-５０

此外，基因工程在抗體技術(shù)上的應(yīng)用使干擾素與抗體能夠有機(jī)地結(jié)合,通過(guò)抗體的靶向作?用,增強(qiáng)干擾素的定向能力，提高干擾素體內(nèi)作用的效率。

５．提高干擾素產(chǎn)量的方法干擾素是一種誘生物質(zhì),必須在一定的誘生劑如病毒、細(xì)菌等作用不才能生成,所以在基因工程中,常常用一些強(qiáng)啟動(dòng)子如色氨酸啟動(dòng)子，將干擾素的表達(dá)從條件型變?yōu)榻M成型,以提高產(chǎn)量。

酵母是一種較為常用的表達(dá)宿主，但其外源基因的大量表達(dá)必須在缺少元機(jī)磷的條件下才能進(jìn)展。通過(guò)對(duì)其酸性磷酸酶酶的阻遏基因及溫度敏感型負(fù)調(diào)控基因進(jìn)展改造,就可以使酵母菌在３５℃的高溫下生長(zhǎng),在２５℃下誘導(dǎo)表達(dá),并且其表達(dá)與無(wú)機(jī)磷的含量無(wú)關(guān)。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明未誘導(dǎo)時(shí)產(chǎn)量為６×１０４UA,而誘導(dǎo)后產(chǎn)量可到達(dá)１×１０７UA。?由于ＩFＮ-α、自、γ性質(zhì)各異,在進(jìn)展表達(dá)時(shí)，ＩFN干的產(chǎn)量往往遠(yuǎn)不及IFN-α、ＩFN-日，因此就必須進(jìn)展表達(dá)體系的改進(jìn)。如利用含噬菌體T５早期啟動(dòng)子及強(qiáng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的高效轉(zhuǎn)錄二表達(dá)體系,可以使IFN－γ的表達(dá)也到達(dá)４×１０９U／L的水平。其方法為用人工合成的T５P２５強(qiáng)啟動(dòng)手｛其中含有啟動(dòng)于及核糖體結(jié)合位點(diǎn))：取代質(zhì)粒pJP１在EcoＲV與HｉnｄＥ之間的Tｅf啟動(dòng)子,形成質(zhì)粒pＪR１Ｒ３,將其用ＨindE線性化后插入ＩFＮEＹ的編碼序列,便可以得到高效的表達(dá)質(zhì)粒IFNγ－IFNY。將IFN基因置于Teｔr基因的上游,有利于轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的篩選和保持〔圖１２-６)O?其中合成的啟動(dòng)區(qū)序列為：

E∞RI３５區(qū)－１０區(qū)?GAAIＴCＡAAAATrrAτTＴGＣＴTτ℃AＧGAＡＡAＡＴTTＴI℃IGTAＴAＡT?E丑nd皿?AGＡIτ℃ATAAATTTGAAGCTAＧＧAGGＴＴTAＡGCTT?啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)四、提取、純化及鑒定對(duì)干擾素的提純可分為粗提和進(jìn)一步純化，以IFN-α為例,粗提時(shí)將菌液５０００r/min離心取細(xì)胞,參加１／１００體積的７ｍｏl/L鹽酸肌冰?。玻枇呀饧?xì)胞后１７０００r/ｍin離心５min，取上清液。用５～１０倍體積的０．１５mol/L棚酸鹽緩沖液稀釋后在１O(jiān)ＩIIII１０１４的NＨ４Ci中透析２０ｈ,再１５０００r／min離心１０ｒＩlino將上清液用８０%(ＮH４〕２S０４

沉淀,用水溶解后再透析去除(NH４)２S０４,再用離子交換的方式別離各種蛋白O如果要進(jìn)一步純化,可用單克隆抗體進(jìn)展親和層析。將Sepｈarose４Ｂ與純化的抗IFN-α單克隆抗體混合振搖，室溫放置４ｈ后低速離心，并用０.１Eｎoｌ/L=Ｎ注fC０３(ｐH８.５)的緩沖液洗去未結(jié)合的抗體,參加等體、積的乙醇膠并振蕩４h以上,將殘存的活性基團(tuán)加以封閉O：用ｐH４.０的醋酸鹽緩沖液及ｐH８.０的Tｒｉｓ－HCｌ緩沖液交ｉ?替洗滌３次,并用pＨ７.５的０.１molＡTrｉSEHCｉ加以平衡１后裝柱。用ｐH７.２的０.０１molJLPＢＳ洗柱至洗脫液‘OＩh８０到基線，將含有IFN的混合液上樣,如一次吸附不完A全可用流出液再上柱一次。用PＢS反復(fù)洗柱，至流出液的１吸收回到基線。用pH２．５的０.１mｏlAGly－ＨCl洗脫并分４段收集,并對(duì)各局部濃度進(jìn)展測(cè)定。最后用ｐH２．５的０.１ｍolＡGｌｙ-ＨCｌ再生,用含０．０１%間的PBS沖洗凈,４℃保存。同時(shí),利用親和層析技術(shù)還可以對(duì)只占總蛋白０.１％～１%的干擾素進(jìn)展別離和濃縮。

五、活性檢測(cè)

１.對(duì)(３二５')ｏligo(A)合成酶活性的誘導(dǎo)在含１％小牛血清?的RPMＩ１６４０培養(yǎng)基中培養(yǎng)２×１０５個(gè)／mlDaｕｄi細(xì)胞,并分別參加１U/m１、１０Ｕ/ｍl、１００U/ｍl、１０００Ｕ/mlＩFN。２４h后９０００r/ｍiｎ離心２min,并將沉淀分散于５００μL冷的含２０mmoiAEｆEP－ES、５mmｏl／ＬMgCl２、I２０ｍmol只LKCl、７mm０１４二硫蘇糖醇、１０%甘氨酸、０５%ＮＰ４０(pH７.５)的裂解液中,冰浴２miｎ后９OOＯr/ｍｉn離心８IIlino取上清與５０μＬｐoly(rI)：ｐｏly〔rC〕瓊脂在３０℃共?。保祄in,離心去除未吸附局部，而將結(jié)合物與２．５mmolA[α－３２p］－ATP及磷酸激酶在３０℃水浴２０h。將混合物上３０μL酸性磯土柱,用３ｍllｍolA鹽酸肌洗脫,將洗脫液與未用IFN誘導(dǎo)的對(duì)照組進(jìn)展比較便可測(cè)出IＦN的活性。

２．抗增生活性在含１５%小牛血清的RPMI１６４０培養(yǎng)基中培養(yǎng)５×１０４個(gè)／ｍlDａｕｄa細(xì)胞，４８h后參加IFＮ，再培養(yǎng)７２h,用２BI型庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞進(jìn)展計(jì)數(shù)，即可以得到IＦN的抗增生活性。

３.細(xì)胞病變抑制作用將在含１０%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)的ＷISH細(xì)胞用０.０３%ＥDＴＡ、０.２５%的膜蛋白酶１mi在室溫下消化２～３min后,倒出消化液,用Eａgle液分散細(xì)胞,然后用含１０％小牛血清的DMEM液配成５×１０５個(gè)/mｌ的細(xì)胞懸液，用微量板在

３７℃含５%C馬的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。用不同稀釋度的０.１mlＩＦN溶液參加各孔后再培養(yǎng)７h。每孔參加０.１ｍl含１００～１０００ＴｃID５０濾過(guò)性口腔炎病毒(VＳV〕進(jìn)展病毒攻擊。將病毒對(duì)照組與細(xì)胞對(duì)照組進(jìn)展比較便可以測(cè)得其抗病毒活性。?六、新型干擾素

１．活性增加的干擾素通過(guò)定點(diǎn)突變或干擾素的嵌合可提高干擾素的活性,如將重組干

擾素自１７位的Cys改為Ser,可提高抗病毒活性１０倍。新型雜合的IFN-αD對(duì)NＫ細(xì)胞的調(diào)節(jié)能力比親本提高了１０～４００倍,如將IＦN－α４與IＦＮtｌ進(jìn)展嵌合,得到的IＦN活性分別是親代的４倍及２０倍。而用鼠ＩFNｔ１的A段與IFN-飩的Ｂ段進(jìn)展雜交,活性可提高１０～１００倍。此外,如上面介紹的將IＦN與TNＦ結(jié)合,可以產(chǎn)生不同的活性。

２．穩(wěn)定性增加的干擾素仍以上面提到的重組ＩＦＮR為例,親代干擾素在一７０℃７５d后

大多數(shù)喪失抗病毒活性,而突變后在同樣條件下保存１５０d仍不失活。

３.改變抗原性的干擾素如將IFN仇的１４１位上Cys用Ｔｙr代替，那么其抗原性發(fā)生改變,不與體內(nèi)自然存在的IFＮ在１爭(zhēng)奪受體，雖然這種抗原性改變的機(jī)率很小，但仍不失為一種研究方向。?４．改變種屬特異性的干擾素IＦN－αＤ在牛細(xì)胞株中活性最高,IFN-αA在人細(xì)胞系中活

性最高,而其嵌合體與兩個(gè)親本都不一樣,在鼠細(xì)胞中的活性最高。第三節(jié)應(yīng)用一、臨床治療方面?干擾素作為較早被研究的用基因工程方法合成的生物活性物質(zhì),雖然在基因的調(diào)取、構(gòu)建、表達(dá)方面仍有較多的工作在進(jìn)展中,但研究的熱點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到了臨床應(yīng)用及臨床前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，并且在較多疾病的治療方面取得了進(jìn)展。

１.抗病毒目前的研究主要集中于抗各類肝炎病毒方面,在抗HＩV、抗HSV等方面也有?較多的研究。

２.提高免疫系統(tǒng)機(jī)能在小鼠實(shí)驗(yàn)中重組ＩFN－γ對(duì)NK細(xì)胞的活性、吞噬細(xì)胞的溶解性、絲裂原誘導(dǎo)的母細(xì)胞化均有促進(jìn)作用,同時(shí)減少外周血及骨髓量。在牛體