生物體內(nèi)藥物分析概論課件 體內(nèi)藥物分析方法建立和評價

第四講生物體內(nèi)藥物分析方法的建立及其評價一、思路概括了解實驗對象與要求→查閱文獻方法→分析關(guān)鍵問題→按照藥物分析方法要求進行實驗設(shè)計→方法建立和優(yōu)化→方法驗證→樣品測試與結(jié)果分析→呈現(xiàn)結(jié)果二、建立分析方法第一階段：實驗前資料調(diào)研1.了解分析對象的理化性質(zhì)，酸堿性、溶解性、穩(wěn)定性、光學(xué)性質(zhì)等。2.了解藥物的代謝途徑、產(chǎn)物和動力學(xué)性質(zhì)，如吸收、分布、代謝、排泄、結(jié)合等。3.取樣對象：體液，如血、尿等；組織，如肝、腦、膽、毛發(fā)等；細胞等等4.分析的目的：代謝途徑和產(chǎn)物，藥動學(xué)研究，臨床藥物監(jiān)測等。第二階段：實驗設(shè)計1.取樣對象的確定2.前處理方法的選擇3.方法選擇：光譜、色譜和免疫方法示例：人血漿中普盧利沙星活性代謝產(chǎn)物NM394的檢測分析方法建立：分析待測物——NM394分析目標(biāo)——建立分析方法可以專屬、靈敏、準確的檢測出血漿中NM394HPLC法——分離分析選擇內(nèi)標(biāo)化合物——準確定量選擇前處理方法——消除干擾、提高檢測濃度分析方法的建立—色譜條件及優(yōu)化：體外方法的建立色譜柱：DiamonsilC18柱(5μm,200mm×4.6mmi.d.)保護柱：DiamonsilTMODS流動相：乙腈-0.5%三乙胺（磷酸調(diào)pH3.0）為21:79流速：1ml/min熒光檢測：λex-280nm,λem-425nm柱溫：30℃內(nèi)標(biāo)化合物為洛美沙星（結(jié)構(gòu)類似、性質(zhì)相近）第三階段：實驗研究（方法建立和評價）1.前處理條件的選擇和優(yōu)化：目的是提取、富集和除干擾雜質(zhì)。2.色譜分離條件的選擇（柱和流動相的變化考察選擇性）和優(yōu)化、檢測波長和靈敏度。3.對照品，空白樣品，空白樣品添加對照品，實際樣品，水加空白樣品。4.方法學(xué)驗證-validation方法學(xué)確證是整個藥代動力學(xué)研究的基礎(chǔ)。所有藥代動力學(xué)研究結(jié)果，都依賴于生物樣品的測定，只有可靠的方法才能得出可靠的結(jié)果。通過準確度、精密度、特異性、靈敏度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等研究建立了測定方法，得到了標(biāo)準曲線后，在檢測過程中還應(yīng)進行方法學(xué)質(zhì)控，制備隨行標(biāo)準曲線并對質(zhì)控樣品進行測定，以確保檢測方法的可靠性。1、國內(nèi)法規(guī)CFDA化學(xué)藥物非臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則化學(xué)藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則9012生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則（2015年版）

2、國際法規(guī)FDA：GuidanceforIndustryBioanalyticalMethodValidationEMEA：Guidelineonbioanalyticalmethodvalidation化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則：方法學(xué)確證1、特異性（specificity）2、標(biāo)準曲線和定量范圍（calibrationcurve）3、定量下限（lowerlimitofquantitation）4、精密度與準確度（precisionandaccuracy）5、樣品穩(wěn)定性（stability）6、提取回收率（extractionrecovery）7、微生物學(xué)和免疫學(xué)分析8、方法學(xué)質(zhì)控（qualitycontrol）特異性特異性是指在樣品中存在干擾成分的情況下，分析方法能夠準確、專一地測定分析物的能力。必須證明測定物質(zhì)是受試藥品的原形藥物或特定活性代謝物生物樣品所含內(nèi)源性物質(zhì)和相應(yīng)代謝物、降解產(chǎn)物不得干擾對樣品的測定，如果有幾個分析物，應(yīng)保證每一個分析物都不被干擾。應(yīng)確定保證分析方法的最佳檢測條件。色譜法至少要考察：6個不同個體的空白生物樣品色譜圖；空白生物樣品外加對照物質(zhì)色譜圖（注明濃度）；用藥后的生物樣品色譜圖以反映分析方法的特異性。對于以軟電離質(zhì)譜為基礎(chǔ)的檢測法（LC-MS、LC-MS-MS）應(yīng)注意考察分析過程中的基質(zhì)效應(yīng)，如離子抑制等。在新藥研究中需要按照要求在報告上提供相應(yīng)數(shù)量的典型色譜圖：如果存在外源性非測定成分影響？（例如中西藥合并給藥）A空白血漿，B空白血漿+生姜提取物→充分考察同時給藥的成分是否會影響待測成分的專一檢測空白血漿+標(biāo)準樣品給藥速效抗暈?zāi)z囊后24h血樣濃度SelectivityForselectivity,analysesofblanksamplesoftheappropriatebiologicalmatrix(plasma,urine,orothermatrix)shouldbeobtainedfromatleastsixsources.Eachblanksampleshouldbetestedforinterference,andselectivityshouldbeensuredatthelowerlimitofquantification(LLOQ).TheanalyteresponseattheLLOQshouldbeatleast5timestheresponsecomparedtoblankresponse.LLOQ與空白相比至少其峰面積需要為空白的5倍。標(biāo)準曲線和定量范圍標(biāo)準曲線反映了所測定物質(zhì)濃度與儀器響應(yīng)值之間的關(guān)系，一般用回歸分析法（如用加權(quán)最小二乘法等）所得的回歸方程來評價。應(yīng)提供標(biāo)準曲線的線性方程和相關(guān)系數(shù)，說明其線性相關(guān)程度。配制測定要求：配制標(biāo)準樣品應(yīng)使用與待測樣品相同生物介質(zhì)；測定不同生物樣品應(yīng)建立各自的標(biāo)準曲線；必須至少用6個濃度建立標(biāo)準曲線；不得用定量范圍外推的方法求算未知樣品的濃度；建立標(biāo)準曲線時應(yīng)隨行空白生物樣品，但計算時不包括該點，僅用于評價干擾。結(jié)果要求：標(biāo)準曲線各濃度點的實測值與標(biāo)示值之間的偏差*在可接受的范圍之內(nèi)時，可判定標(biāo)準曲線合格。偏差=【（實測值－標(biāo)示值）/標(biāo)示值】×100%；最低濃度點～±20%以內(nèi)；其余濃度點的偏差在～±15%以內(nèi)當(dāng)線性范圍較寬的時候，推薦采用加權(quán)的方法對標(biāo)準曲線進行計算，以使低濃度點計算得比較準確。最小二乘法回歸Min[∑(Yi-Yi`)2]低濃度點對離差平方和的貢獻最?。划?dāng)濃度范圍跨度較大時候，低濃度點的觀測值和估計值之間的差異就會變大。加權(quán)最小二乘法Min[∑W(Yi-Yi`)2]低濃度點權(quán)重大，高濃度點權(quán)重小加權(quán)最小二乘法回歸：LLOQ/LQC80%~120%；其余85%~115%如何確定標(biāo)準曲線線性范圍？如何提供所需的標(biāo)準曲線數(shù)據(jù)？一種生物基質(zhì)在整個實驗研究中進行幾條標(biāo)準曲線的測試？如何配制線性良好的標(biāo)準曲線樣品？預(yù)實驗結(jié)果指導(dǎo)線性范圍的選擇；需要提供所有濃度點標(biāo)示值與實測值的偏差，且符合要求；需要提供標(biāo)準曲線的截距和斜率及回歸系數(shù)；一般求算3條標(biāo)準曲線（與批間、批內(nèi)精密度一同完成）；實驗中可以采用雙標(biāo)準曲線，即開始測試前隨行1條，樣品完成測試后隨行1條，保證實驗過程中穩(wěn)定。配制標(biāo)準曲線樣品：相同的生物基質(zhì)；保證標(biāo)準溶液的濃度正確；保證稀釋倍數(shù)相同儲備液→工作溶液→系列工作溶液（呈線性）+空白血漿（按照1:20或者1:10稀釋）→得標(biāo)準添加樣品（呈線性）Calibration/StandardCurveAsufficientnumberofstandardsshouldbeusedtoadequatelydefinetherelationshipbetweenconcentrationandresponse.Thenumberofstandardsusedinconstructingacalibrationcurvewillbeafunctionoftheanticipatedrangeofanalyticalvaluesandthenatureoftheanalyte/responserelationship.Acalibrationcurveshouldconsistofablanksample(matrixsampleprocessedwithoutinternalstandard),azerosample(matrixsampleprocessedwithinternalstandard),andsixtoeightnon-zerosamplescoveringtheexpectedrange,includingLLOQ.定量下限（LowerlimitofquantitationLLOQ）定量下限是標(biāo)準曲線上的最低濃度點測定要求：LLOQ應(yīng)能滿足測定3～5個消除半衰期時樣品中的藥物濃度或能檢測出Cmax的1/10～1/20的藥物濃度結(jié)果要求：準確度應(yīng)在真實濃度的80%～120%范圍內(nèi)；相對標(biāo)準差(RSD)應(yīng)小于20%；至少應(yīng)由5個標(biāo)準樣品測試結(jié)果證明。定量下限是所測定生物樣品待測組分的最低濃度，并非體外樣品所測最低濃度。由于樣品前處理濃縮等處理，生物樣品的定量下限往往可以更低。不用信噪比法進行定量下限的確定。精密度與準確度精密度是指在確定的分析條件下，相同介質(zhì)中相同濃度樣品的一系列測量值的分散程度。測定要求：通常用質(zhì)控樣品的批內(nèi)和批間相對標(biāo)準差（RSD）來考察方法的精密度。結(jié)果要求：一般RSD應(yīng)小于15％；在LLOQ附近RSD應(yīng)小于20％準確度是指在確定的分析條件下，測得的生物樣品濃度與真實濃度的接近程度(即質(zhì)控樣品的實測濃度與真實濃度的偏差)測定要求：重復(fù)測定已知濃度分析物樣品可獲得準確度。結(jié)果要求：一般應(yīng)在85％～115％范圍內(nèi)(一般偏差應(yīng)少于15％)，在LLOQ附近應(yīng)在80％～120％范圍內(nèi)。質(zhì)控樣品：濃度選擇低濃度～～LLOQ的3倍以內(nèi)高濃度～～接近于標(biāo)準曲線的上限中間濃度～～任意在中間選一個濃度樣品數(shù)量批內(nèi)精密度～每一濃度至少制備并測定5個樣品。批間精密度～應(yīng)在不同天連續(xù)制備并測定，至少有連續(xù)3個分析批（不少于45個樣品）的結(jié)果合格。一般在預(yù)實驗之后進行標(biāo)準曲線及準確度、精密度的考察分析批次1——標(biāo)準曲線1，LLOQ×5，LQC×5，MQC×5，HQC×5分析批次2——標(biāo)準曲線2，LQC×5，MQC×5，HQC×5分析批次3——標(biāo)準曲線3，LQC×5，MQC×5，HQC×53個分析批獲得3條標(biāo)準曲線，5個LLOQ數(shù)據(jù)，每個分析批各5個的LQC/MQC/HQC數(shù)據(jù)，3批共45個數(shù)據(jù)樣品穩(wěn)定性含藥生物樣品：室溫、冰凍、凍融、不同存放時間以確定生物樣品穩(wěn)定的存放條件和時間儲備液的穩(wěn)定性樣品處理后的溶液中分析物的穩(wěn)定性指導(dǎo)藥代動力學(xué)試驗和分析過程生物樣品取出后放置時間——室溫穩(wěn)定性是否可以重復(fù)測定及結(jié)果影響——凍融穩(wěn)定性取樣到測定的時間——冰凍穩(wěn)定性一次自動進樣樣品的個數(shù)——復(fù)溶液穩(wěn)定性指導(dǎo)原則上未明確列出具體測定和結(jié)果要求。穩(wěn)定性考察的目的，以保證檢測結(jié)果的準確性和重現(xiàn)性。StabilityAllstabilitydeterminationsshoulduseasetofsamplespreparedfromafreshlymadestocksolutionoftheanalyteintheappropriateanalyte-free,interference-freebiologicalmatrix.Stocksolutionsoftheanalyteforstabilityevaluationshouldbepreparedinanappropriatesolventatknownconcentrations.1.FreezeandThawStabilityAnalytestabilityshouldbedeterminedafterthreefreezeandthawcycles.Atleastthreealiquotsateachofthelowandhighconcentrationsshouldbestoredattheintendedstoragetemperaturefor24hoursandthawedunassistedatroomtemperature.Whencompletelythawed,thesamplesshouldberefrozenfor12to24hoursunderthesameconditions.Thefreeze–thawcycleshouldberepeatedtwomoretimes,thenanalyzedonthethirdcycle.2.Short-TermTemperatureStabilityThreealiquotsofeachofthelowandhighconcentrationsshouldbethawedatroomtemperatureandkeptatthistemperaturefrom4to24hours(basedontheexpecteddurationthatsampleswillbemaintainedatroomtemperatureintheintendedstudy)andanalyzed.3.Long-TermStabilityThestoragetimeinalong-termstabilityevaluationshouldexceedthetimebetweenthedateoffirstsamplecollectionandthedateoflastsampleanalysis.Long-termstabilityshouldbedeterminedbystoringatleastthreealiquotsofeachofthelowandhighconcentrationsunderthesameconditionsasthestudysamples.Theconcentrationsofallthestabilitysamplesshouldbecomparedtothemeanofback-calculatedvaluesforthestandardsattheappropriateconcentrationsfromthefirstdayoflong-termstabilitytesting.4.StockSolutionStabilityThestabilityofstocksolutionsofdrugandtheinternalstandardshouldbeevaluatedatroomtemperatureforatleast6hours.Aftercompletionofthedesiredstoragetime,thestabilityshouldbetestedbycomparingtheinstrumentresponsewiththatoffreshlypreparedsolutions.5.Post-PreparativeStabilityThestabilityofprocessedsamples,includingtheresidenttimeintheautosampler,shouldbedetermined.Thestabilityofthedrugandtheinternalstandardshouldbeassessedovertheanticipatedruntimeforthebatchsizeinvalidationsamplesbydeterminingconcentrationsonthebasisoforiginalcalibrationstandards.一般以列表形式給出數(shù)據(jù)結(jié)果；對于以測定代謝產(chǎn)物而不是原型藥物的研究，穩(wěn)定性還需要觀察是否有代謝轉(zhuǎn)化的情況發(fā)生。提取回收率從生物樣本基質(zhì)中回收得到分析物質(zhì)的響應(yīng)值除以標(biāo)準品產(chǎn)生的響應(yīng)值即為分析物的提取回收率，也可以說是將供試生物樣品中分析物提取出來供分析的比例?；厥章剩缴飿悠诽崛『箜憫?yīng)值/標(biāo)準品響應(yīng)值（濃度相當(dāng)）考察高、中、低3個濃度的提取回收率，其結(jié)果應(yīng)精密并具有可重現(xiàn)性。指導(dǎo)原則上未明確列出具體測定和結(jié)果要求。提取回收率依照各前處理方法不同而規(guī)定不同，一般來說，提取回收率穩(wěn)定且儀器可以有足夠響應(yīng)即可。液液萃取>80％；蛋白沉淀>60％；固相萃取>90％基質(zhì)效應(yīng)的計算A純凈溶液濃度CB空白血漿沉淀蛋白＋標(biāo)準溶液濃度CCQC血漿沉淀蛋白濃度C絕對基質(zhì)效應(yīng)=B/A×100%絕對回收率=C/B×100%方法學(xué)質(zhì)控應(yīng)在生物樣本分析方法確證完成以后開始測定未知樣品。在測定生物樣品中的藥物濃度時應(yīng)進行質(zhì)量控制，以保證所建立的方法在實際應(yīng)用中的可靠性。推薦由獨立的人員配制不同濃度的質(zhì)控樣品對分析方法進行考核。每個未知樣品一般測定一次，必要時可進行復(fù)測。隨行標(biāo)準曲線：來自同一個體的生物樣品最好在同一批中測定。每個分析批生物樣品測定時應(yīng)建立新的標(biāo)準曲線，并隨行測定高、中、低三個濃度的質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品：每個濃度至少雙樣本，并應(yīng)均勻分布在未知樣品測試順序中。當(dāng)一個分析批中未知樣品數(shù)目較多時，應(yīng)增加各濃度質(zhì)控樣品數(shù)，使質(zhì)控樣品數(shù)大于未知樣品總數(shù)的5%。質(zhì)控樣品測定結(jié)果的偏差一般應(yīng)小于15%，低濃度點偏差一般應(yīng)小于20%。最多允許1/3的質(zhì)控樣品結(jié)果超限，但不能出現(xiàn)在同一濃度質(zhì)控樣品中。如質(zhì)控樣品測定結(jié)果不符合上述要求，則該分析批樣品測試結(jié)果作廢。其他：標(biāo)準曲線的范圍不能外延，任何濃度高于定量上限的樣品，應(yīng)采用相應(yīng)的空白介質(zhì)稀釋后重新測定。對于濃度低于定量下限的樣品，在進行藥代動力學(xué)分析時，在達到Cmax以前取樣的樣品應(yīng)以零值計算，在達到Cmax以后取樣的樣品應(yīng)以無法定量（Notdetectable,ND）計算，以減小零值對AUC計算的影響。需要列出所有分析批次的隨行標(biāo)準曲線數(shù)據(jù)；列出所有分析批次的QC樣品結(jié)果整個分析過程應(yīng)當(dāng)遵從預(yù)先制訂的實驗室SOP以及GLP原則。FDA對于生物樣品的分析方法較為詳細，除