第六節(jié)轉(zhuǎn)錄后處理轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的修飾-真核生物mRNA的帽子和尾巴公開課一等獎(jiǎng)優(yōu)質(zhì)課大賽微課獲獎(jiǎng)?wù)n件

第六節(jié)轉(zhuǎn)錄后處理

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物修飾——真核生物mRNA帽子和尾巴第1頁(yè)第1頁(yè)在真核生物中，大部分成熟mRNA都含有5’帽子，同時(shí)還含有3’多聚A尾巴。這是真核生物mRNA主要特性。第2頁(yè)第2頁(yè)一、帽子成熟mRNA分子沒有自由5’端。5’端是一個(gè)以5’-5’三磷酸二酯鍵相連二核苷酸，并且在5’一個(gè)核苷酸總是N7-甲基鳥氨酸（m7GpppX），不能被RNAase水解。mRNA5’端這種結(jié)構(gòu)就稱為帽子。第3頁(yè)第3頁(yè)不同真核生物mRNA含有不同帽子,同一個(gè)生物也常含有不同帽子。N7-甲基鳥氨酸（m7GpppX）稱為帽子0，單細(xì)胞真核生物，如酵母，只有帽子0。如在原來(lái)轉(zhuǎn)錄物第一個(gè)核苷酸2’-O位上產(chǎn)生甲基化，則組成帽子1（包含帽子0），其符號(hào)為m7GpppXm。這是除了單細(xì)胞真核生物其余真核生物主要帽子形式。在高等生物中，假如第一個(gè)核苷酸是A，則在AN6位上還有一個(gè)甲基化。在有些真核生物中，在第二個(gè)核苷酸2’-O位上還能夠再甲基化，組成帽子2，其符號(hào)為m7GpppXmpYm。第4頁(yè)第4頁(yè)第5頁(yè)第5頁(yè)mRNA5’帽子結(jié)構(gòu)是由一系列酶催化。其中RNA鳥氨酸基轉(zhuǎn)移酶稱為戴帽酶。甲基供體都為S-腺苷甲硫氨酸（SAM），失去甲基后變?yōu)镾-腺苷高半胱氨酸。第6頁(yè)第6頁(yè)帽子結(jié)構(gòu)功效（1）帽子結(jié)構(gòu)為核糖體對(duì)與mRNA辨認(rèn)提供了信號(hào)。帽子0部分結(jié)構(gòu)，包括5‘端鳥嘌呤核苷酸，Ｎ－７甲基和５’－５’三磷酸二酯鍵，是核糖體辨認(rèn)所必須；帽子１和２結(jié)構(gòu)中甲基化也能夠增進(jìn)核糖體對(duì)ｍRNA結(jié)合，但并非決定性。Ｎ－７甲基作用是引入一個(gè)正電荷而不是甲基本身，用乙基代替甲基能同樣增進(jìn)核糖體結(jié)合。缺乏5’帽子mRNA，不能進(jìn)行有效翻譯。第7頁(yè)第7頁(yè)（2）帽子結(jié)構(gòu)增長(zhǎng)mRNA穩(wěn)定性，保護(hù)mRNA免遭5’外切核酸酶作用。（3）引起作用。外加帶有帽子結(jié)構(gòu)RNA能增進(jìn)流感病毒RNA（+）鏈合成。并且帽子結(jié)構(gòu)和開始12~15個(gè)核苷酸還共價(jià)結(jié)合于新合成RNA（+）鏈5’端。帽子1或帽子2結(jié)構(gòu)對(duì)于這種引起是必須。第8頁(yè)第8頁(yè)二、多聚（A）尾巴大多數(shù)真核生物mRNA都含有3’末端多聚A尾巴。記為poly（A）+。多聚A尾巴大約為200b。多聚A尾巴不是由DNA編碼，而是由一個(gè)分子量為300KDaRNA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（又稱為poly（A）聚合酶）催化，以ATP為前體，一個(gè)一個(gè)地聚合到mRNA3’末端。第9頁(yè)第9頁(yè)poly（A）尾巴并不是加在轉(zhuǎn)錄中斷3’末端，而是在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’末端由一個(gè)分子量為360KDa特異酶作用切除一段。此酶能辨認(rèn)切點(diǎn)上游方向13~20堿基附近序列AAUAAA及切點(diǎn)下游方向GUGUGUG，然后再由poly（A）聚合酶催化加上poly（A）尾巴。如U突變?yōu)镚，則切除作用和聚合作用均明顯減少。第10頁(yè)第10頁(yè)第11頁(yè)第11頁(yè)第七節(jié)轉(zhuǎn)錄后處理（二）

基因間序列清除——穩(wěn)定RNA從多基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中分離第12頁(yè)第12頁(yè)一、不穩(wěn)定RNA與穩(wěn)定RNA在原核生物中，多基因mRNA生成后，絕大部分直接作為模板去翻譯各個(gè)基因所編碼蛋白質(zhì)，并以此為手段協(xié)調(diào)相關(guān)基因表示量。原核生物mRNA壽命很短，其半衰期常為幾分鐘。這與原核生物調(diào)控機(jī)制是相關(guān)，當(dāng)一個(gè)蛋白質(zhì)不再需要時(shí)，只要簡(jiǎn)樸地關(guān)閉其mRNA合成就行。第13頁(yè)第13頁(yè)在真核生物中，可能有尤其機(jī)制來(lái)延長(zhǎng)需要翻譯mRNA壽命，而縮短不再需要mRNA壽命。rRNA和tRNA則不同，它們不是翻譯模板，而是蛋白質(zhì)合成機(jī)器組成部分。不論在原核生物中還是真核生物中，都很穩(wěn)定，普通半衰期為幾個(gè)小時(shí)。第14頁(yè)第14頁(yè)rRNA和tRNA與mRNA不同：（1）rRNA和tRNA分子5’端都是單磷酸，而不是三磷酸；（2）rRNA和tRNA分子都比原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物小，即比對(duì)應(yīng)DNA小；（3）全部tRNA都含有原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中沒有異常堿基。因此都需要做轉(zhuǎn)錄處理，以刪除基因間序列及基因內(nèi)介入序列。第15頁(yè)第15頁(yè)二、rRNA轉(zhuǎn)錄后處理原核生物以E.coli為例：其有三種rRNA，即5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA，它們分別含有120、1541和2904個(gè)核苷酸。其特點(diǎn)：（1）與tRNA基因混雜在一個(gè)操縱元中；大腸桿菌有7個(gè)這樣操縱元。其中rRNA基因在各操縱元中相對(duì)位置都相同，即16SrDNA，間隔tDNA，23SrDNA，5SrDNA，收尾tDNA；但tDNA在各操縱元數(shù)量、種類和位置都不相同。（2）這7個(gè)操縱元大多數(shù)都集中在復(fù)制原點(diǎn)兩側(cè)附近，其轉(zhuǎn)錄方向與DNA復(fù)制方向相同。第16頁(yè)第16頁(yè)當(dāng)rrn操縱元轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一個(gè)多基因30SRNA后，必須切除先導(dǎo)序列、拖尾序列和基因間序列。這些工作都有RNAaseⅢ完畢。其特點(diǎn)：必須作用于雙鏈RNA，在兩條鏈切點(diǎn)通常是錯(cuò)開兩個(gè)堿基對(duì)。第17頁(yè)第17頁(yè)第18頁(yè)第18頁(yè)真核生物有四種rRNA，即5.8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA和5SrRNA。前三者基因構(gòu)成一個(gè)轉(zhuǎn)錄元，產(chǎn)生45S前體RNA。第19頁(yè)第19頁(yè)第20頁(yè)第20頁(yè)三、tRNA轉(zhuǎn)錄后處理原核生物tRNA基因轉(zhuǎn)錄單元大多數(shù)是多基因。同一個(gè)tRNA幾個(gè)基因拷貝能夠轉(zhuǎn)錄在一條RNA中，不同tRNA也能夠轉(zhuǎn)錄在一條RNA中，還有tRNA與rRNA組成轉(zhuǎn)錄單元。第21頁(yè)第21頁(yè)以大腸桿菌tRNATyr1為例。它攜帶酪氨酸t(yī)RNA，辨認(rèn)密碼子為GAU。這個(gè)分子含有85個(gè)核苷酸，在大腸桿菌DNA中有兩個(gè)基因拷貝，每個(gè)基因是350個(gè)核苷酸，兩個(gè)基因間有一段200bP間隔子。兩個(gè)基因轉(zhuǎn)錄成一條RNA。第22頁(yè)第22頁(yè)tRNATyr1轉(zhuǎn)錄后處理過程主要有五步（1）一個(gè)能辨認(rèn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)Ⅰ內(nèi)切核酸酶在箭頭所指處切斷；（2）RNAaseD辨認(rèn)CCA末端，一個(gè)一個(gè)切除7個(gè)核苷酸。生成分子稱為前tRNA。（3）RNAaseP在箭頭所指處切斷，負(fù)責(zé)

5’- P末端處理；（4）RNAaseD除去

3’末端二個(gè)核苷酸。（5）有6個(gè)堿基通過專一性酶處理變?yōu)楫惓A基。第23頁(yè)第23頁(yè)tRNA加工酶主要包括tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶，RNAaseP、RNAaseD、RNAaseⅢ及RNAaseP4。（1）tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶：能特異地以ATP和CTP為前體催化tRNA3’末端CCA生成。tRNA基因有兩種類型，一個(gè)是有CCA序列（Ⅰ型），一個(gè)是沒有CCA序列（Ⅱ型）。成熟有功效tRNA都有CCA3’-OH末端，這是tRNA結(jié)合并攜帶氨基酸功效所必須。第24頁(yè)第24頁(yè)原核生物tRNA絕大多數(shù)為Ⅰ型，少數(shù)噬菌體為Ⅱ型；真核生物均為Ⅱ型。tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)是專一，當(dāng)tRNA缺乏CCA末端時(shí)，總是生成CCA末端。此酶沒有種族特異性，不同種類酶與tRNA配合都能添加CCA末端。第25頁(yè)第25頁(yè)（2）RNAaseP：是一個(gè)內(nèi)切酶。全部tRNA5’末端都由該酶產(chǎn)生。大腸桿菌RNAaseP溫度敏感突變體在非許可溫度時(shí)使40各種tRNA前體發(fā)生積累。該酶是一個(gè)核蛋白，由兩部分組成。這兩部分在不同物種之間是非常保守。各種tRNA前體分子與RNAaseP反應(yīng)，都能取得該tRNA正確5’端序列。RNAaseP識(shí)別tRNA空間構(gòu)象，而不是幾個(gè)核苷酸序列。各種tRNA都有其保守核苷酸，以維持tRNA空間構(gòu)象。第26頁(yè)第26頁(yè)（3）RNAaseD

：為外切核酸酶。作用于tRNA3’末端多出核苷酸，直到CCA序列為止。其作用是一個(gè)一個(gè)CCA外圍切除核苷酸。第27頁(yè)第27頁(yè)第八節(jié)轉(zhuǎn)錄后處理（三）

內(nèi)元清除——RNA拼接第28頁(yè)第28頁(yè)RNA拼接機(jī)制研究，是80年代生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中最有氣憤課題之一。它不但處理了不連續(xù)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物拼接問題，并且對(duì)理解不連續(xù)基因起源及整個(gè)生命起源與進(jìn)化問題都是有力推動(dòng)。核酸分子催化功效發(fā)覺拓寬了人們對(duì)酶結(jié)識(shí)。第29頁(yè)第29頁(yè)內(nèi)元分為四類（1）Ⅰ類內(nèi)元：由四個(gè)10~12bp保守序列及其構(gòu)成二級(jí)結(jié)構(gòu)；這類內(nèi)元分布比較廣。（2）Ⅱ類內(nèi)元：不具備保守序列和其二級(jí)結(jié)構(gòu)。（3）Ⅲ類內(nèi)元：指核基因mRNA前體中內(nèi)元，snRNA參與拼接機(jī)制。（4）Ⅳ類內(nèi)元：tRNA前體拼接。第30頁(yè)第30頁(yè)一、tRNA拼接在酵母約400個(gè)核Trnajyin中有40個(gè)是不連續(xù)基因，每一個(gè)都含有一個(gè)內(nèi)元，位于反密碼子3’方向且與反密碼子毗鄰。內(nèi)元長(zhǎng)度為14~45bp。攜帶同一個(gè)氨基酸各種tRNA中內(nèi)元序列是相關(guān)，而不同氨基酸t(yī)RNA內(nèi)元序列是不相關(guān)。第31頁(yè)第31頁(yè)tRNA基因內(nèi)元沒有為拼接酶系所辨認(rèn)一致序列。因此，在拼接之前前體中反密碼子總是處于雙鏈RNA狀態(tài)，從而受到保護(hù)而不致為拼接酶所破壞。這部分雙鏈?zhǔn)沟梅疵艽a子嚕噗柄部比成熟tRNA反密碼子嚕噗柄部長(zhǎng)得多。而三葉草結(jié)構(gòu)其余部分與成熟tRNA完全同樣。因此，

拼接酶系辨認(rèn)是共同二級(jí)結(jié)構(gòu)，而不是保守序列。第32頁(yè)第32頁(yè)體外試驗(yàn)發(fā)覺tRNA拼接環(huán)節(jié)：由一個(gè)內(nèi)切酶所催化兩個(gè)磷酸二酯鍵斷裂，釋放出一條線狀內(nèi)元分子和兩個(gè)互相由二級(jí)結(jié)構(gòu)作用力連接在一起“tRNA半分子”。這一步反應(yīng)不需要ATP。tRNA半分子不久采用成熟tRNA分子構(gòu)象，只但是在反密碼子環(huán)上留下一個(gè)切刻。然后再發(fā)生第二步反應(yīng)，即由RNA連接酶所催化依賴于ATP連接反應(yīng)。第33頁(yè)第33頁(yè)第34頁(yè)第34頁(yè)二、Ⅰ類內(nèi)元拼接Ⅰ類內(nèi)元特點(diǎn):(1)拼接點(diǎn)含有序列特性.5’拼接點(diǎn)和3’拼接點(diǎn)大部分序列為U…….G.第35頁(yè)第35頁(yè)(2)內(nèi)元內(nèi)還含有比較保守四種10~12核苷酸序列，分別以5’-P-Q-R-S-3’表示。P序列能與Q序列互補(bǔ)，R序列能與S序列互補(bǔ)，形成一個(gè)中部關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。這樣，位于內(nèi)元序列中靠近5’拼接點(diǎn)一段序列就能與兩個(gè)拼接點(diǎn)邊界序列配對(duì)，將兩個(gè)拼接點(diǎn)拉在一起便于磷酸二酯鍵切斷和再連接。內(nèi)元中能與兩個(gè)拼接點(diǎn)邊界序列配正確一段序列稱為內(nèi)部引導(dǎo)序列（IGS）。第36頁(yè)第36頁(yè)第37頁(yè)第37頁(yè)用放射性標(biāo)識(shí)鳥嘌呤核苷處理35SRNA，發(fā)覺拼接環(huán)節(jié)：（1）取代轉(zhuǎn)酯反應(yīng)：G通過正常磷酸二酯鍵與內(nèi)元序列5’端相連。這是鳥嘌呤核苷3’-OH攻打第一個(gè)外元與內(nèi)元之間磷酸二酯鍵結(jié)果，同時(shí)在第一個(gè)外元3’端產(chǎn)生了-OH。（2）取代轉(zhuǎn)酯反應(yīng)：第一個(gè)外元3’-OH攻打第二個(gè)外元與內(nèi)元之間磷酸二酯鍵，結(jié)果兩個(gè)外元連接起來(lái)。而釋放出來(lái)內(nèi)元再通過兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，釋放出15和4核苷酸兩個(gè)小片段，最后形成穩(wěn)定線狀分子，稱為L(zhǎng)-19。第38頁(yè)第38頁(yè)第39頁(yè)第39頁(yè)內(nèi)元進(jìn)行兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)意義也許是使基因拼接不可逆進(jìn)行下去。整個(gè)反應(yīng)過程都沒有蛋白質(zhì)參與，即拼接這種活性是35SRNA內(nèi)元本身含有性質(zhì)，稱為本身催化。其特點(diǎn)：催化已有一處磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)變成另一處新磷酸二酯鍵，且不需要能量。內(nèi)元既是酶，又是相應(yīng)底物。只是此酶在反應(yīng)結(jié)束后不再生，而是變成了新分子。因此，內(nèi)元又稱為RNA重排酶或RNA異構(gòu)酶。第40頁(yè)第40頁(yè)RNA催化功效發(fā)對(duì)于理解生命進(jìn)化過程有重大意義。很也許在原始生命中，RNA催化斷裂-連接反應(yīng)是最早出現(xiàn)催化過程。依據(jù)從遺傳信息到蛋白質(zhì)合成過程中，RNA所表現(xiàn)出多方面作用，人們?cè)缇屯茰y(cè)RNA是生物體系中最早出現(xiàn)大分子種類。第41頁(yè)第41頁(yè)酵母拼接過程中所涉及2’磷酸酯鍵，是DNA不也許有。因此，RNA催化功效必定出現(xiàn)在DNA成為遺傳信息載體之前。即，在原始生命中遺傳信息載體是RNA而不是DNA。由于DNA穩(wěn)定性和空間結(jié)構(gòu)方面某種優(yōu)勢(shì)而取代了RNA成為主要遺傳物質(zhì)，并且蛋白質(zhì)以其側(cè)鏈多樣性和靈活性取代了RNA成為主要催化劑。第42頁(yè)第42頁(yè)三、編碼RNA成熟酶內(nèi)元在許多Ⅰ類內(nèi)，存在著外元和內(nèi)元聯(lián)合編碼一個(gè)蛋白質(zhì)——RNA成熟酶現(xiàn)象。Ⅱ類內(nèi)元也發(fā)覺了類似情況，如眼蟲葉綠體有32KDaRNA成熟酶。

以酵母線粒體細(xì)胞色素b基因（cob基因，又稱BOX基因）為例，來(lái)闡明RNA成熟酶生成和其調(diào)整機(jī)制。第43頁(yè)第43頁(yè)不同酵母含有長(zhǎng)短不同cob基因。長(zhǎng)基因編碼序列為1155bp，整個(gè)基因長(zhǎng)6400bp，包含6個(gè)外元（B1-B6）和5個(gè)內(nèi)元（Ⅰ1-Ⅰ5）。短基因大約是長(zhǎng)基因二分之一，包含3個(gè)外元和兩個(gè)內(nèi)元。第一個(gè)外元相稱于長(zhǎng)基因外元B1-B4，而長(zhǎng)基因內(nèi)元Ⅰ1-Ⅰ3在短基因中消失。長(zhǎng)短基因編碼一樣385氨基酸，含有一樣表示能力。第44頁(yè)第44頁(yè)RNA成熟酶：cob基因中Ⅰ2-Ⅰ4各編碼一個(gè)為刪除各自內(nèi)元序列所不可缺乏蛋白質(zhì)。第45頁(yè)第45頁(yè)以內(nèi)元2所編碼RNA成熟酶為例，闡明成熟酶mRNA產(chǎn)生過程：第一個(gè)外元B1編碼細(xì)胞色素bN端139氨基酸（417bp）。第一個(gè)內(nèi)元Ⅰ1756bp，其中三個(gè)閱讀框均被阻斷。B2是一個(gè)很小外元，只有14bp。Ⅰ2長(zhǎng)1240bp，在其前有一個(gè)開放閱讀框，與B1+B2閱讀框完全一致。這樣，當(dāng)Ⅰ1被除去時(shí)，B1、B2和Ⅰ2及其以后部分就連接在一起，成為一個(gè)較短mRNA前體。這樣，從B1AUG密碼子開始，共有144+280=424個(gè)密碼子，能翻譯產(chǎn)生一個(gè)423個(gè)氨基酸RNA成熟酶。其前144個(gè)氨基酸與細(xì)胞色素bN端144個(gè)氨基酸完全相同，而其余279個(gè)氨基酸則由Ⅰ2編碼。第46頁(yè)第46頁(yè)當(dāng)Ⅰ2清除之后，B1、B2和B3互相銜接起來(lái)，不再產(chǎn)生清除Ⅰ2這個(gè)RNA成熟酶。正是由于RNA成熟酶造成合成本身能力喪失，因此細(xì)胞內(nèi)RNA成熟酶含量極低。也闡明RNA成熟酶構(gòu)成了一個(gè)自動(dòng)調(diào)整負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)。正是這個(gè)負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)闡明RNA成熟酶只作用其相應(yīng)內(nèi)元拼接過程，對(duì)其它內(nèi)元拼接不起作用。第47頁(yè)第47頁(yè)四、Ⅱ類內(nèi)元拼接Ⅱ類內(nèi)元除了前提到兩個(gè)拼接點(diǎn)序列特性外，在其3’末端尚有特性序列（1）離開3；拼接點(diǎn)6~12bp序列比較保守，一致序列為PyPuPyPyTA*Py，其中A*為100%保守一個(gè)核苷酸。（2）在上述7核苷酸序列中間和兩側(cè)各有一段3~5核苷酸短序列能與上游方向核苷酸互補(bǔ)；而保守A*總是不包括在這些互補(bǔ)序列之中。即，在形成部分雙鏈結(jié)構(gòu)中，保守A*總是不在雙鏈部分，而是向外突出“芽狀物”之中。第48頁(yè)第48頁(yè)體外試驗(yàn)：將細(xì)胞色素c氧化酶亞基內(nèi)元15γ克隆到包含SP6開啟子質(zhì)粒pKM2中，可得到大量包含此內(nèi)元RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。這種產(chǎn)物有體外自我拼接能力，但與Ⅰ類內(nèi)元有所不同：不需要帶有3’-OH鳥核苷（酸），也不需要一價(jià)陽(yáng)離子，僅需要5mM左右Mg++和少許亞精胺；如增加Mg++濃度，能夠不需要亞精胺。反應(yīng)最適溫度約45℃。第49頁(yè)第49頁(yè)切下來(lái)內(nèi)元呈套索狀，由2’，5’-磷酸二酯鍵連接成環(huán)形。套索狀產(chǎn)物能夠HELA細(xì)胞提取液（含有去分枝酶）處理可變?yōu)榫€形分子。以套索狀產(chǎn)物為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，則在分枝處快速終止反應(yīng)。由于套索狀結(jié)構(gòu)含有自由3’-OH末端，因此能夠用與套索互補(bǔ)單鏈DNA為模板，以套索為引物合成DNA鏈。兩種反應(yīng)都能夠用RNAaseⅠ切除套索結(jié)構(gòu)而終止反應(yīng)。第50頁(yè)第50頁(yè)Ⅱ類內(nèi)元拼接反應(yīng)也是轉(zhuǎn)酯作用，發(fā)動(dòng)第一個(gè)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)正是保守A*。A以其2’-OH發(fā)動(dòng)親核襲擊；保守A不參與二級(jí)結(jié)構(gòu)堿基配對(duì)，確保了它發(fā)動(dòng)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)功效。第51頁(yè)第51頁(yè)五、核基因mRNA拼接核基因mRNA內(nèi)元拼接點(diǎn)序列很簡(jiǎn)樸，均為CU…….AG。在內(nèi)元3’末端，也有一個(gè)核苷酸序列，其一致序列是PyXPyTPuA*Py。這兩個(gè)保守序列突變就不能正確拼接mRNA前體，但僅靠這樣簡(jiǎn)樸保守序列是不也許確保正確拼接，snRNA參與了這一辨認(rèn)過程。第52頁(yè)第52頁(yè)真核生物細(xì)胞中，有105~106個(gè)100~300bP小分子RNA。它們有是RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄，有是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，其中有還像mRNA同樣戴上帽子。在核中小RNA稱為snRNA，在細(xì)胞質(zhì)中稱為scRNA。普通情況下，它們多以核蛋白形式存在，即snRNP和scRNP。第53頁(yè)第53頁(yè)各種snRNA之間有序列共同性，造成各種sNRNP也也許有共同蛋白質(zhì)亞基，因此一個(gè)sNRNP抗體能辨認(rèn)許各種snRNP。除了共同蛋白質(zhì)亞基形成關(guān)鍵顆粒外，每一個(gè)snRNP尚有各自輔助蛋白因子。第54頁(yè)第54頁(yè)在各種snRNA中，只有U1sNRNA5’端序列能夠與mRNA前體兩個(gè)拼接點(diǎn)序列互補(bǔ)。U1snRNA已發(fā)覺于哺乳動(dòng)物，鳥類，昆蟲細(xì)胞中。人類U1snRNA中除了RNA外，還含有8個(gè)蛋白質(zhì)亞基。其5’末端11個(gè)核苷酸呈單鏈狀態(tài)，因此能與拼接點(diǎn)序列互補(bǔ)。第55頁(yè)第55頁(yè)第56頁(yè)第56頁(yè)snRNA與拼接點(diǎn)配對(duì)情況模式如圖。上圖表示snRNA與內(nèi)元互相結(jié)合總體結(jié)構(gòu)；下圖為一個(gè)典型內(nèi)元序列與snRNA堿基配對(duì)情況。對(duì)于大多數(shù)內(nèi)元來(lái)說(shuō)，其左拼接點(diǎn)有4~6堿基配對(duì)，其右拼接點(diǎn)只有兩個(gè)堿基配對(duì)。第57頁(yè)第57頁(yè)與拼接點(diǎn)結(jié)合是整個(gè)U1snRNP性質(zhì)，提純snRNA不能與拼接點(diǎn)結(jié)合。UIsnRNA與其它蛋白質(zhì)也許構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜拼接體，U1snRNA只有在這樣一個(gè)復(fù)合體中才干辨認(rèn)拼接點(diǎn)序列。當(dāng)前還發(fā)覺了其它種類snRNP：U2snRNP、U5snRNP、U4/U6snRNP。迄今沒有發(fā)覺這些小RNA含有酶活性。第58頁(yè)第58頁(yè)第十節(jié)逆轉(zhuǎn)錄第59頁(yè)第59頁(yè)逆轉(zhuǎn)錄酶是1960年由Temin等人發(fā)覺，在研究鳥類路斯氏肉瘤病毒時(shí)發(fā)覺了一個(gè)依賴于RNADNA聚合酶。發(fā)覺了各種高等真核生物RNA腫瘤病毒都有逆轉(zhuǎn)錄酶，這些RNA病毒統(tǒng)稱為還原病毒。全部還原病毒都有三個(gè)基因，一個(gè)為gag，編碼病毒種族特異性抗原；一個(gè)是pol，編碼逆轉(zhuǎn)錄酶；一個(gè)是env，編碼病毒外膜蛋白。這三個(gè)基因只是指其編碼序列，而實(shí)際上經(jīng)過不同轉(zhuǎn)錄和翻譯后處理能夠產(chǎn)生不同蛋白質(zhì)。第60頁(yè)第60頁(yè)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組為RNA，普通稱為正鏈病毒。逆轉(zhuǎn)錄酶負(fù)責(zé)使病毒RNA基因組（正鏈RNA）轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNA鏈，這個(gè)過程稱為逆轉(zhuǎn)錄。合成DNA鏈稱為負(fù)鏈DNA。以負(fù)鏈DNA為模板合成新DNA鏈稱為正鏈DNA。第61頁(yè)第61頁(yè)逆轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄區(qū)別1過程和產(chǎn)物完全相反。2逆轉(zhuǎn)錄酶與RNA聚合酶完全不同。（1）從本質(zhì)上說(shuō)逆轉(zhuǎn)錄酶屬于DNA聚合酶，其前體為dNTP，產(chǎn)物為DNA鏈；（2）必須有引物存在下才干起始聚合；（3）逆轉(zhuǎn)錄酶是金屬蛋白，需要Zn++激活。3目標(biāo)不同：轉(zhuǎn)錄在于制造基因產(chǎn)物RNA或DNA；還原病毒直接目標(biāo)在于基因組重組。第62頁(yè)第62頁(yè)正是由于逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄作用發(fā)覺，才使中心法則得到補(bǔ)充和完善。1957年Crick提出了中心法測(cè)(centraldogma)DNA→RNA→蛋白質(zhì)DNARNA蛋白質(zhì)第63頁(yè)第63頁(yè)逆轉(zhuǎn)錄酶是一類非常復(fù)雜酶，在其簡(jiǎn)樸一條肽鏈上含有各種酶活性。主要酶活性有DNA聚合酶活性、RNAaseH活性，DNA內(nèi)切酶活性，DNA旋轉(zhuǎn)酶活性，螺旋酶活性及tRNA結(jié)合活性。第64頁(yè)第64頁(yè)1DNA聚合酶活性：逆轉(zhuǎn)錄酶有雙重活性，既有RNA指導(dǎo)DNA聚合酶活性，又有DNA指導(dǎo)DNA聚合酶活性。因此，此酶能以RNA和DNA為模板，在引物存在下合成DNA。發(fā)覺，大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ也能以RNA為模板拷貝出DNA鏈。第65頁(yè)第65頁(yè)還原病毒逆轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶

區(qū)別（1）利用不同模板——引物體系來(lái)區(qū)分。逆轉(zhuǎn)錄酶能利用（Cm）n（dG）15-進(jìn)行有效DNA合成而不能利用（dT）n（A）15-和（Da）（dT）15-；而DNA聚合酶恰恰相反。（2）逆轉(zhuǎn)錄酶不具備3’5’和5’3’外切酶活性，且逆轉(zhuǎn)錄沒保真度比原核和真核生物DNA聚合酶低得多，錯(cuò)配幾率比它們高1~3個(gè)數(shù)量級(jí)。這也是各種RNA腫瘤病毒含有很高自發(fā)突變?cè)?。?6頁(yè)第66頁(yè)2RNAaseH活性：還原病毒要將自己?jiǎn)捂淩NA分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子才干整合到寄主染色體中。要完畢這種轉(zhuǎn)變，就必須有降解RNA酶。因此，所有逆轉(zhuǎn)錄酶都有RNAaseH活性。但逆轉(zhuǎn)錄酶只有外切酶活性，而無(wú)內(nèi)切酶活性，因此作用較慢。第67頁(yè)第67頁(yè)3DNA內(nèi)切酶活性：所有逆轉(zhuǎn)錄酶都有一定DNA內(nèi)切酶活性，這種酶含有位點(diǎn)特異性。但有Mn++存在時(shí)，則失去位點(diǎn)特異性，成為對(duì)超螺旋更為敏感切刻酶活性。也許與重組功效相關(guān)。第68頁(yè)第68頁(yè)4DNA旋轉(zhuǎn)酶活性：報(bào)道ASV病毒粒子有DNA旋轉(zhuǎn)酶活性，能使Ⅰ型DNA變?yōu)棰?型。5螺旋酶活性：病毒AMV逆轉(zhuǎn)錄酶αβ和α都含有旋轉(zhuǎn)酶活性。6tRNA結(jié)合活性：所有逆轉(zhuǎn)錄酶都含有與其引物tRNA結(jié)合能力。

第69頁(yè)第69頁(yè)逆轉(zhuǎn)錄酶生物活性1RNA指導(dǎo)DNA聚合酶，能夠利用病毒RNA為模板合成一條互補(bǔ)DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；2DNA指導(dǎo)DNA聚合酶，以新形成DNA鏈為模板，合成另一條互補(bǔ)DNA鏈，形成雙鏈DNA分子；3RNAaseH活性，指除去雜合分子中RNA，能夠從兩個(gè)方向水解DNA-RNA。第70頁(yè)第70頁(yè)EndEnd第71頁(yè)第71頁(yè)以四膜蟲大rRNA前體分子拼接為例，闡明Ⅰ類內(nèi)元拼接分子機(jī)制四膜蟲特點(diǎn):微核——二倍體基因組保留在微核中；大核——基因擴(kuò)增發(fā)生在大核。在大核，rDNA擴(kuò)增產(chǎn)生了大量染色體外線狀分子，每個(gè)分子都是回紋序列二聚體。二聚體含兩個(gè)完全相同轉(zhuǎn)錄單元，轉(zhuǎn)錄成35SrRNA前體。含有內(nèi)元26SrRNA位于這個(gè)前體3’端。第72頁(yè)第72頁(yè)將分離但大核進(jìn)行保溫，35SRNA釋放出413核苷酸長(zhǎng)線狀RNA單鏈，即內(nèi)元序列，沒有游離外元出現(xiàn)。如延長(zhǎng)保溫