動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課

動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第1頁植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B去掉細(xì)胞壁去掉細(xì)胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜合原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁雜種細(xì)胞細(xì)胞分裂分化發(fā)育愈傷組織雜種植株1、動(dòng)物細(xì)胞融合概念是什么？2、動(dòng)植物細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上有何區(qū)分？這對它們雜交或融合過程有什么影響？3、植物體細(xì)胞雜交誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常見方法有哪些？那動(dòng)物細(xì)胞融合呢？4、動(dòng)物細(xì)胞融合與植物原生質(zhì)體融合基礎(chǔ)原理是否相同？是什么原理？5、動(dòng)物細(xì)胞融合有什么意義？主要應(yīng)用在哪些方面？6、植物體細(xì)胞雜交可得到雜種植株，動(dòng)物細(xì)胞融合后能象電影上一樣形成雜種動(dòng)物個(gè)體嗎?為何？動(dòng)物細(xì)胞A動(dòng)物細(xì)胞B誘導(dǎo)、融合雜合細(xì)胞有絲分裂2個(gè)完整雜交細(xì)胞AB動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第2頁一、動(dòng)物細(xì)胞融合1.細(xì)胞融合：是指兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞融合為一個(gè)細(xì)胞過程。⑴自然發(fā)生：

受精卵

動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第3頁鼠細(xì)胞人細(xì)胞人工誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合雜交細(xì)胞⑵人工誘導(dǎo)：利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合誘導(dǎo)原因：聚乙二醇、滅活病毒或電激等。

動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第4頁仙臺(tái)病毒紫外線滅活喪失感染活性（不感染細(xì)胞）保留融合活性（誘導(dǎo)細(xì)胞融合）①什么是病毒滅活？滅活是指用物理或化學(xué)伎倆使病毒失去感染能力，不過并不破壞病毒抗原結(jié)構(gòu)。②滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合原理病毒表面含有糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞相互凝聚，細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第5頁滅活病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜連接細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞（細(xì)胞膜含有一定流動(dòng)性）動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第6頁物理法融合效率較高,且對細(xì)胞（原生質(zhì)體）傷害小,易操作、控制和觀察。太空中處于失重狀態(tài)，不一樣種細(xì)胞（原生質(zhì)體）更輕易親近；為何在太空中細(xì)胞（原生質(zhì)體）融合率會(huì)大大上升？為何選取物理法誘導(dǎo)？動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第7頁正在融合淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞正在融合雞血細(xì)胞⑶動(dòng)物細(xì)胞融合原理：細(xì)胞膜流動(dòng)性動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第8頁細(xì)胞膜流動(dòng)性滅活病毒、PEG、電激等融合后細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，形成完整雜交細(xì)胞誘導(dǎo)伎倆:融合后細(xì)胞類型:AB雜種細(xì)胞遺傳物質(zhì)有什么特點(diǎn)？三種AA、AB、BB（A、B）含兩種生物遺傳物質(zhì)動(dòng)物細(xì)胞融合過程原理:動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第9頁2、動(dòng)物細(xì)胞融合應(yīng)用1.突破有性雜交方法局限,使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。2.成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等主要伎倆。鼠—雞、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—雞、人—蛙、酵母菌—雞、人—胡蘿卜等3、主要用途：制備單克隆抗體。動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第10頁取得雜種植株物理、化學(xué)方法（同左）滅活病毒

物理（離心、振蕩、電激）化學(xué)（聚乙二醇）直接誘導(dǎo)細(xì)胞融合去壁—原生質(zhì)體融合—誘導(dǎo)新壁—雜種植株細(xì)胞膜流動(dòng)性細(xì)胞膜流動(dòng)性結(jié)果誘導(dǎo)方法步驟融合原理動(dòng)物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交比較項(xiàng)目植物、動(dòng)物細(xì)胞融合比較取得雜交細(xì)胞小結(jié)1動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第11頁【例1】能使動(dòng)物細(xì)胞融合特有誘導(dǎo)因子是（）A.離心B.滅活病毒C.電刺激D.振動(dòng)【例2】融合后雜交細(xì)胞遺傳物質(zhì)有何特點(diǎn)（）含有原來兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳信息B.能無限增殖C.可形成新個(gè)體D.培養(yǎng)過程會(huì)貼壁【例3】動(dòng)物細(xì)胞融合作用中最主要是（）A.克服遠(yuǎn)源雜交不親和B.制備單克隆抗體C.培育新物種D.生產(chǎn)雜種細(xì)胞

BB初試牛刀A動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第12頁使用對應(yīng)抗體檢測乙肝病毒——抗原二、單克隆抗體制備

醫(yī)院普通怎樣檢測人體內(nèi)是否存在乙肝病毒？乙肝病毒模式圖

凡能夠引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答物質(zhì)叫做抗原。1、什么是抗原？比如花粉、病菌、病毒等。有時(shí)本身組織或細(xì)胞也會(huì)成為抗原，如癌細(xì)胞等。動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第13頁抗原決定簇：抗原表面含有一些特定化學(xué)基團(tuán)，能決定抗原特異性，是免疫細(xì)胞識(shí)別抗原主要依據(jù)?？乖ǔＪ怯啥鄠€(gè)抗原決定簇組成動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第14頁

2、什么是抗體？由何種細(xì)胞產(chǎn)生？主要分布在哪里?起何作用？

當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激劑后由效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）產(chǎn)生，而且能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合含有免疫功效球蛋白——抗體。

抗體分布于血清中，也分布于組織液及外分泌液中。動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第15頁抗體與對應(yīng)抗原特異性結(jié)合動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第16頁3、抗體傳統(tǒng)生產(chǎn)方法：從血清中分離抗體各種漿細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)各種抗體抗原動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第17頁血清抗體（也稱多克隆抗體）

由血清中提取抗體是由不一樣淋巴細(xì)胞產(chǎn)生各種抗體混合物，可達(dá)百萬種以上，稱為多克隆抗體(抗原通常是由多個(gè)抗原決定簇組成,只針對一個(gè)抗原決定簇起作用漿細(xì)胞群產(chǎn)生特異性抗體叫做單克隆抗體)。特點(diǎn)：產(chǎn)量低、純度低、特異性差、反應(yīng)不夠靈敏?？乖患兛贵w不純

抗原動(dòng)物體內(nèi)刺激效應(yīng)B抗體動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第18頁

每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一個(gè)化學(xué)性質(zhì)單一，特異性強(qiáng)抗體。假如利用單個(gè)B淋巴細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖（克?。?，形成細(xì)胞群，這么細(xì)胞群就有可能產(chǎn)生出化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)抗體——單克隆抗體。問題：怎樣取得化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)抗體呢？動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第19頁在體外培養(yǎng)條件下，一個(gè)B淋巴細(xì)胞能無限增殖形成細(xì)胞群嗎？什么樣細(xì)胞能夠在體外無限增殖呢？

——腫瘤細(xì)胞！動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第20頁

5.技術(shù)思緒重點(diǎn)雜交瘤細(xì)胞

HAT篩選McAb大量培養(yǎng)PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合免疫B

脾礦物油骨髓瘤瘤問題:在培養(yǎng)體系中,有5種細(xì)胞.B細(xì)胞、瘤細(xì)胞,和雜交細(xì)胞。咱們還是拿不到McAb,怎么辦?篩選！篩出雜交瘤細(xì)胞。怎么篩?

又是一個(gè)思緒問題。關(guān)鍵一步動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第21頁⑵怎樣誘導(dǎo)融合？

加入聚乙二醇（PEG）⑴怎樣得到B淋巴細(xì)胞？6.制備單克隆抗體過程動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第22頁⑶細(xì)胞兩兩融合后，有哪些類型？B-BB-瘤(雜交瘤細(xì)胞)瘤-瘤⑷怎樣篩選出雜交瘤細(xì)胞？

單克隆抗體制備過程中，總共有兩次篩選，第一次篩選出雜交瘤細(xì)胞，第二次篩選出能產(chǎn)生特異性抗體雜交瘤細(xì)胞，兩次篩選原理和方法是不相同。

①首先用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第23頁①細(xì)胞合成DNA有D和S兩條路徑，其中D路徑能被氨基喋呤阻斷。②人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA合成路徑，但普通不分裂增殖。

③鼠骨髓瘤細(xì)胞中只有D路徑，沒有S路徑，可是能不停分裂增殖。你想到篩選雜交瘤細(xì)胞方案了么？

小資料：動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第24頁在培養(yǎng)液中加入氨基喋呤，搜集增殖細(xì)胞！加入氨基喋呤后，使D合成路徑阻斷，僅有D合成路徑骨髓瘤細(xì)胞及其彼此融合細(xì)胞就不能增殖，但人淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后雜種細(xì)胞因?yàn)槟軌蚶昧馨图?xì)胞中S路徑合成DNA而增殖。動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第25頁注射抗原效應(yīng)B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合各種雜交細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基

篩選1抗原-抗體雜交法克隆化單克隆抗體

篩選24.第一次篩選出雜交瘤細(xì)胞為何需進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和專一抗體檢測？動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第26頁通常采取有限稀釋克隆細(xì)胞方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋，接種在多孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超出一個(gè)，再由這些單細(xì)胞克隆生長，然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌抗體，那些上清液可與特定抗原結(jié)合培養(yǎng)孔為陽性孔。最終選出分泌預(yù)定特異抗體雜交細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)充培養(yǎng)。②再篩選出能分泌所需抗體雜交瘤細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第27頁陽性孔方法——抗原-抗體雜交法

在單克隆抗體制備過程中，兩次篩選原理和方法是不相同。動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第28頁動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第29頁單克隆抗體篩選雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞體外或體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)篩選骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞融合特異性雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞系提取經(jīng)過免疫B淋巴細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體制備過程：特點(diǎn)：既能產(chǎn)生專一抗體又能大量繁殖特點(diǎn)：特異性強(qiáng)靈敏度高可大量制備注射抗原免疫動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第30頁單克隆抗體制備1、怎樣取得能分泌專一抗體B淋巴細(xì)胞？2、從何處取得較多B淋巴細(xì)胞？3、用什么方法能夠使B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合？4、怎樣篩選出雜交瘤細(xì)胞？5、篩選出雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗體都一樣嗎？6、怎樣取得只產(chǎn)生特異性抗體雜交瘤細(xì)胞？7、怎樣取得大量單一抗體？重復(fù)注射特定抗原，免疫小鼠。小鼠脾臟PEG、滅活病毒等利用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選否用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，稀釋度要確保每個(gè)孔內(nèi)不多于一個(gè)細(xì)胞?？乖贵w雜交法檢測——呈陽性反應(yīng)體內(nèi)或體外大量培養(yǎng)特異雜交瘤細(xì)胞，從中提取單一抗體。動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第31頁單克隆抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合選擇培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)抗體檢測產(chǎn)生所需抗體雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)小鼠腹腔內(nèi)增殖單克隆抗體各種雜交細(xì)胞1、該過程中用到了兩種技術(shù)小結(jié)2單克隆抗體制備過程：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)2、單克隆抗體制備過程三個(gè)“一”：一個(gè)誘導(dǎo)細(xì)胞融合新方法，產(chǎn)生了一個(gè)新細(xì)胞，得到了一個(gè)優(yōu)勢抗體。滅活病毒誘導(dǎo)融合雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體優(yōu)勢：特異性強(qiáng)、靈敏度高，可大量制備動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第32頁7、單抗隆抗體應(yīng)用①作為診療試劑②定位診療腫瘤、心血管畸形等疾病

用于體外診療人類和動(dòng)植物疾病及病原判定，純度高、特異性強(qiáng)，含有準(zhǔn)確、高效、簡易、快速優(yōu)點(diǎn)。③用于治療疾病和運(yùn)載藥品

利用同位素標(biāo)識(shí)單抗，在特定組織成像

制成生物導(dǎo)彈，將藥品定向帶到癌細(xì)胞所在位置，在原位殺死癌細(xì)胞，療效高、副作用小。單克隆抗體優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，并能夠大量制備。動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第33頁動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第34頁結(jié)協(xié)議位素單抗-----生物導(dǎo)彈單抗放射性同位素動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第35頁項(xiàng)目動(dòng)物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交原理細(xì)胞膜流動(dòng)性細(xì)胞膜流動(dòng)性和植物細(xì)胞全能性融合前提分散成單個(gè)細(xì)胞去除細(xì)胞壁誘導(dǎo)方法聚乙二醇、離心、振動(dòng)、電激、滅活病毒聚乙二醇、離心、振動(dòng)、電激、結(jié)果取得雜種細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物取得雜種植株用途制備單克隆抗體培育作物新品種意義使遠(yuǎn)緣雜交成為可能克服遠(yuǎn)緣雜交障礙動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第36頁對比比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交單克隆抗體制備原理融合前處理促融方法

用途過程第一步第二步第三步第四步細(xì)胞膜流動(dòng)性、細(xì)胞全能性細(xì)胞膜流動(dòng)性、細(xì)胞增殖酶解法去壁小鼠要免疫處理物理法化學(xué)法物理、化學(xué)、生物法原生質(zhì)體制備融合親本細(xì)胞準(zhǔn)備原生質(zhì)體融合與篩選動(dòng)物細(xì)胞融合與兩次篩選雜種細(xì)胞形成與培養(yǎng)對產(chǎn)生特定抗體雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)雜種植株判定單克隆抗體分離提純單抗有利于疾病診療、治療

取得具優(yōu)良性狀雜種植株動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第37頁⑶圖中B為________過程，常見_________作為誘導(dǎo)劑，該細(xì)胞繼承___________遺傳特征，既能__________,又能___________

。B體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞足夠數(shù)量細(xì)胞群注射到小鼠腹腔AC

1.下列圖為某同學(xué)依據(jù)雜交瘤技術(shù)方法，設(shè)計(jì)生產(chǎn)破傷風(fēng)桿菌抗體試驗(yàn)方案⑴該試驗(yàn)方案目是

；⑵A是從小鼠脾臟中取得_______,該細(xì)胞能夠產(chǎn)生

；制備單克隆抗體B細(xì)胞專一抗體細(xì)胞融合滅活病毒雙親細(xì)胞分泌專一抗體無限增殖動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第38頁1975年Kohler和Milstein單克隆抗體技術(shù)在生產(chǎn)和使用抗體方面開創(chuàng)了新紀(jì)元，圖10示單克隆抗體制備流程階段示意圖。請據(jù)圖回答以下問題：圖10（1）該技術(shù)是在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和

技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來。（2）圖10中細(xì)胞A體外培養(yǎng)不含有分裂能力，但能分泌

，細(xì)胞B體外培養(yǎng)能夠

。（3）動(dòng)物細(xì)胞融合常見方法是

。圖10（1）動(dòng)物細(xì)胞融合（2）分泌特異性抗體、無限增殖（3）PEG（滅活病毒、電刺激）動(dòng)物細(xì)胞的融合和單克隆抗體上課第39頁（4）細(xì)胞融合是隨機(jī)過程，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，要篩選出

細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，為了促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖，常向培養(yǎng)液中加入

（激素）。（5）培養(yǎng)2周后，即測定培養(yǎng)細(xì)胞特征，篩選出

細(xì)胞置于不一樣孔內(nèi)（如圖所表示）培養(yǎng)。此操作前要將培養(yǎng)細(xì)胞稀釋到7～10個(gè)細(xì)胞/ml，每孔滴入0.1ml細(xì)胞稀釋液，其目標(biāo)是

。（6）要取得大量單克隆抗體，可對取得雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行

培養(yǎng)