血液中TNFα TGFβ及的學(xué)習(xí)課件

血液中TNFαTGFβ及的學(xué)習(xí)課件第1頁(yè)/共15頁(yè)血液中TNF-α、TGF-β及ACE的含量在預(yù)測(cè)放射性大鼠肺損傷動(dòng)物模型中的價(jià)值第2頁(yè)/共15頁(yè)研究背景胸部腫瘤在放療過程中不可避免的使腫瘤臨近正常肺組織受到照射，而肺是輻射的敏感器官，對(duì)照射耐受性較低，因而受照射時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同程度的肺損傷，稱為放射性肺病(radiationpneumopathy,RP)。臨床上RP有兩種表現(xiàn)形式，即早期的急性放射性肺炎(acuteradiation-inducedpneumonitis，ARP)和后期的放射性纖維化(radiation-inducedpulmonaryfibrosis，RPF）。目前RP的治療辦法不多,尤其是RPF一旦發(fā)生就難以逆轉(zhuǎn),導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降。因此,對(duì)RP的研究愈來(lái)愈受到人們的重視。第3頁(yè)/共15頁(yè)放射性肺損傷的發(fā)病機(jī)理的研究始于20世紀(jì)50年代，當(dāng)時(shí)多為病理形態(tài)學(xué)觀察。進(jìn)入80年代后，集中于“關(guān)鍵靶細(xì)胞”的研究（歸納起來(lái)有幾種學(xué)說(shuō)：①肺泡上皮細(xì)胞損傷；②肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷；③肺泡巨噬細(xì)胞病毒參與等）。目前該領(lǐng)域研究已經(jīng)進(jìn)入分子生物學(xué)水平，其標(biāo)志為細(xì)胞因子學(xué)說(shuō)的提出，即細(xì)胞因子媒介的多細(xì)胞間的相互作用貫穿放射性肺損傷的全過程。第4頁(yè)/共15頁(yè)立論依據(jù)眾所周之，肺部照射的作用靶為：Ⅱ型肺泡細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，肺巨噬細(xì)胞，成纖維細(xì)胞。肺Ⅱ型細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞受照射后，釋放促炎性細(xì)胞因子（IL-1β，IL-6，TNF-α等），誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放粗纖維化因子（TGF-β，PDGF等），并繼而通過一系列自分泌和旁分泌過程刺激成纖維細(xì)胞增生和合成細(xì)胞基質(zhì)蛋白，最終導(dǎo)致放射性肺損傷的產(chǎn)生。放射性肺損傷發(fā)生發(fā)展過程中細(xì)胞因子的變化可以是導(dǎo)致?lián)p傷發(fā)生的原因或啟動(dòng)因素，也可以是損傷發(fā)生過程中的伴隨變化，檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子的變化有望預(yù)測(cè)放射性肺損傷的發(fā)生或檢測(cè)其發(fā)展過程，細(xì)胞因子還可以作為放射性肺損傷的干預(yù)靶點(diǎn)，預(yù)防放射性肺損傷的發(fā)生。第5頁(yè)/共15頁(yè)TNF-α:TNF-α是細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的啟動(dòng)因子，在放射性肺炎的發(fā)生和維持過程中有著重要地位。在TNF-α的作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞的反應(yīng)性改變，引起微血管內(nèi)凝血同時(shí)TNF-α發(fā)揮陽(yáng)性化學(xué)趨化作用，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞的滲出，啟動(dòng)炎性反應(yīng)。此外，TNF-α引發(fā)IL-1、IL-6和MCP等其它細(xì)胞因子的合成釋放，產(chǎn)生細(xì)胞因子的“瀑布效應(yīng)”。因此，TNF-α在放射性肺炎的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。在Rube的放射性動(dòng)物模型中，肺部接受照射后TGF-α、IL-1α和IL-6等炎性因子的表達(dá)存在一“雙峰現(xiàn)象”。另外，有報(bào)導(dǎo)證實(shí)其可作為小劑量重復(fù)照射大鼠放射性肺損傷的監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一。第6頁(yè)/共15頁(yè)TGF-β:TGF-β的活性和功能異常將導(dǎo)致纖維增生性疾病的發(fā)生，放射治療后正常組織損傷其特征為間質(zhì)細(xì)胞丟失和過度的纖維化。TGF-β在放射引起的正常組織損傷中的作用最早是通過對(duì)小鼠肝臟模型的研究證實(shí)的。結(jié)果顯示，放射后TGF-β表達(dá)具有劑量依賴性關(guān)系。動(dòng)物試驗(yàn)研究顯示TGF-β與多種組織（皮膚，小腸，乳腺和肺等）照射后纖維化有關(guān)。

TGF-β是刺激成纖維細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的重要生長(zhǎng)因子之一，其水平升高已被視為放射性肺損傷的標(biāo)志之一。在眾多的促放射性纖維化發(fā)生和形成介導(dǎo)因子中，被認(rèn)為是最密切的。第7頁(yè)/共15頁(yè)ACE:血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）以表面糖蛋白的形式存在于內(nèi)皮細(xì)胞的管腔面，肺的毛細(xì)血管是體內(nèi)最大的血管床，血液循環(huán)中的ACE多源于肺內(nèi)皮細(xì)胞，肺內(nèi)皮細(xì)胞ACE合成或分泌減少，肺血管形成異?；蜓撼渑娴榷紩?huì)導(dǎo)致循環(huán)血液中ACE水平降低。ACE的生物學(xué)功能是將血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，而后者是已知的致纖維化因子，能刺激核增殖因子ＮＦ－κB的表達(dá)，ＮＦ－κB可以調(diào)節(jié)IL-6，MCP-1等炎性因子的表達(dá)，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEⅠ）能通過減少ＭＣＰ－１的產(chǎn)生，從而抑制了單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的聚集及其活性，抑制ＴＮＦ－α的產(chǎn)生，抑制豚鼠肺巨噬細(xì)胞氧自由基的產(chǎn)生，抑制炎性反應(yīng)和纖維化的發(fā)生。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院的試驗(yàn)研究結(jié)果提示，血漿ACE含量可望作為放射性肺炎的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

第8頁(yè)/共15頁(yè)研究目的小劑量分次照射大鼠建立放射性肺損傷動(dòng)物模型探討血漿中TNF-α、TGF-β及ACE在放療過程中的含量變化與放射性肺損傷易感性的相關(guān)性,探討其作為放射性肺損傷易感性指標(biāo)的可能性。第9頁(yè)/共15頁(yè)實(shí)驗(yàn)流程第10頁(yè)/共15頁(yè)材料與方法1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年SPF級(jí)雌性Wistar大鼠224只，體重18O～200g。1．2分組：完全隨機(jī)分為3組，照射2Gy/f組30只，照射10Gy/f組30只，正常對(duì)照組30只。1．3照射方法：采用60Coγ射線，照射右肺，鉛塊遮擋左肺及縱隔,鉛塊厚度10cm,SSD=lm，照射野2cm×3cm(吸收劑量率=XGy/min),照射總劑量：30Gy,周末休息。照射前使用戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔麻醉,使用自制固定裝置將大鼠仰臥于治療床上。照射后等待大鼠自然蘇醒,對(duì)照組大鼠只麻醉不進(jìn)行照射。1．4血清標(biāo)本采集：分別于1w,3w,5w,10w,15w,25w用5ml注射器從大鼠右心房（抽取血液2～3ml緩慢注入離心管),在4℃普通離心機(jī),3000r/min的條件下離心,收集上清液置入凍存管中,在-20℃條件下凍存待測(cè)。

第11頁(yè)/共15頁(yè)1．5血清標(biāo)本測(cè)定：采用酶聯(lián)免疫吸附法統(tǒng)一檢測(cè)血液中TNF-α、TGF-β1及ACE含量。1．6取材:分別于1w,3w,5w,10w,15w,26w幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每次處死5只。以戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射,麻醉后開胸,分離肺與膈肌，將心臟、肺臟整體取出,將整個(gè)右肺固定于10％甲醛液中,常規(guī)脫水、浸蠟、包埋,切片(5μm),行HE染色及Masson染色。光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)改變，高倍鏡下攝片。1．7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第12頁(yè)/共15頁(yè)觀察指標(biāo)(1)動(dòng)物活體外觀:體重、精神狀態(tài)、進(jìn)食、排便、毛發(fā)脫落。(2)計(jì)算肺系數(shù):電子天平稱肺重,計(jì)算肺系數(shù)。肺系數(shù)=肺重(mg)/體重(g)。(3)大體標(biāo)本觀察:肺組織表面、顏色、質(zhì)地、彈性、有無(wú)腫脹、有無(wú)充血、出血。(4)肺組織形態(tài)學(xué)變化:石蠟塊5μm厚連續(xù)切片,HE染色觀察肺組織并計(jì)算平均肺泡間隔寬度,每張切片在400倍顯微鏡下取5個(gè)視野,用病理圖象分析儀分別測(cè)量肺泡壁寬度和肺泡腔寬度,求平均值,計(jì)算平均肺泡間隔寬度。平均肺泡間隔寬度=平均肺泡壁寬度/平均肺泡腔寬度。第