基因工程基礎課件

第10章基因工程基礎

第一節(jié)基因工程概述第二節(jié)目的基因的獲得第三節(jié)分子克隆中常用的載體第四節(jié)分子克隆中常用的工具酶第五節(jié)目的基因和載體連接、轉化、篩選第六節(jié)基因工程和醫(yī)藥煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversityDNA克隆克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合.獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning),即無性繁殖.技術水平:DNA克隆:分子克隆(molecularclone)細胞克隆個體克隆(動物或植物)第一節(jié)基因工程概述煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversityDNA克隆:應用酶學的方法,在體外將各種來源的DNA(同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的)與載體DNA接合成一具有自我復制能力的分子——復制子(replicon),繼而通過轉化或轉染宿主細胞,篩選出含有目的基因的轉化子,再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子,也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA).煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity分切轉篩表接煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity第二節(jié)目的基因的獲得一目的基因的獲得:化學合成聚合酶鏈式反應(PCR)方法擴增建立基因組DNA文庫構建cDNA文庫煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity化學合成法:

要求:1)已知目的基因的序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列

2)片段不宜太長工具:自動化DNA合成儀應用:1)合成PCR引物

2)寡核苷酸探針

3)人工接頭序列及較小的基因煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity聚合酶鏈式反應(PCR)方法擴增1985年美國科學家Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction,PCR)技術PCR是應用最廣的分子生物學技術之一,可用來快速在體外擴增DNA,PCR技術在臨床檢驗和分子生物學中的應用十分廣泛.PCR技術就是在體外的離心管中通過酶促反應有選擇地大量擴增(包括分離)一段目的基因的技術,即體外進行DNA復制.煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity需要的物質:模板DNA,引物,dNTP(Mg2+),TaqDNA聚合酶4種反應混合物經(jīng)歷變性、退火、延伸三步

94℃,熱變性,雙鏈解開

55℃,冷卻退火,引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結合

72℃,TaqDNA聚合酶作用下,新鏈延伸,形成互補DNA雙鏈如此30個循環(huán)可獲得230個基因片段煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity聚合酶鏈反應原理煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity建立基因組DNA文庫基因組DNA文庫:分離供體細胞中的染色體DNA,酶切后,將這些染色體DNA片段與某種載體相接,而后轉入大腸桿菌,建立包含有供體染色體DNA片段的克隆株,特點:克隆株群體提供全套遺傳信息,即完整的基因組DNA煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity構建基因組文庫過程:⑴分離純化基因組DNA⑵制備全部基因組的DNA片段

①機械斷裂法(超聲波或高速攪拌)斷裂片段兩端沒有與克隆載體匹配的粘末端,因此插入載體之前還需要進行修飾加工,少用②限制性內(nèi)切酶降解(鳥槍法)(常用Sau3A)斷裂片段兩端有與克隆載體匹配的粘末端,可以直接與處理過的載體連接⑶DNA片斷與載體的連接常用載體:λ噬菌體⑷轉化細菌

1個克隆含有基因組的某個片段,整個克隆群體就包含基因組的全部基因片段總和.煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity構建cDNA文庫cDNA文庫:以mRNA為模板在反轉錄酶的作用下將形成的互補DNA(cDNA)建立基因文庫.特點:無內(nèi)含子,長度比基因組基因小,操作簡單mRNA比基因組中基因少,篩選基因工作量小mRNA中拷貝數(shù)大于基因組中的拷貝數(shù),利于獲得較多的模板.可在原核細胞中表達有生物活性蛋白不同種類不同狀態(tài)的細胞的cDNA文庫不同不能研究基因組的結構功能煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity2)第一股cDNA合成

以Oligo(dT)為引物:從模板3’末端開始,沿模板3’→5’方向合成隨機引物:以6～8個核苷酸為隨機引物,從mRNA的不同結合點合成全長cDNA第一鏈

3)第二股cDNA的合成

自身引導法外加引物合成法

煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity4)cDNA與載體連接和導入宿主細胞煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity根據(jù)使用目的分為：克隆載體：使插入的外源DNA序列擴增表達載體：使插入的外源DNA序列轉錄翻譯成多肽鏈理想的質粒載體,應具備以下幾個條件(1)能自主復制,即本身是復制子(2)具有一種或多種限制酶的單一切割位點,并在此位點中插入外源基因片段,不影響本身的復制功能(3)在基因組中有1-2個篩選標記,為寄主細胞提供易于檢測的表型特征,(4)分子量要小,多拷貝,易于操作.煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity一質粒載體1.質粒的基本特性本質是細菌染色體以外的遺傳物質,是一種簡單的,能自主復制的環(huán)狀DNA分子.命名:前一個小寫p代表質粒,后兩個大寫英文字母代表發(fā)現(xiàn)者或實驗室,數(shù)字代表編號,如pBR322煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity1、接大腸桿菌于4mlLB培養(yǎng)基

2、37℃振蕩培養(yǎng)過夜

3、取1.5ml菌液于Ep管,5000rpm離心3min,棄上清

4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖,50mM/LEDTApH8.0,25mM/LTris-HClpH8.0)充分混合

5、加入0.2ml溶液II(0.2mM/LNaOH,1％SDS),輕輕翻轉混勻,置于冰浴5min

6、加入0.15m1預冷溶液III(5mol/LKAc,pH4.8),輕輕翻轉混勻,置于冰浴5min

7、10000rpm離心15min,取上清液于另一新Ep管

8、加入等體積的異戊醇,混勻后于靜置10min

9、再以10000rpm離心5min,棄上清

10、用70％乙醇0.5ml洗滌一次,抽干所有液體

11、待沉淀干燥后,溶于0.05mlTE緩沖液中煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity3.大腸桿菌質粒載體1)pSC101質粒載體第一個克隆真核基因的載體(非洲爪蟾卵母細胞rDNA)煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity

AmprORITetr2)pBR322質粒:一種克隆質粒ORI:復制起始點,保證高拷貝自我復制.結構:Ampr,

Tetr:兩個抗性基因用于篩選陽性克隆.PstI,BamHI:兩個單酶切位點用于插入目的基因煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity3)多功能質粒-pUC質粒pUC質粒由pBR322改建成的,帶有LacZ基因.LacZ上有多克隆位點,插入外源基因后在X-gal平板上使原先的藍斑變成白斑.煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity4)pET系統(tǒng)(Novagen公司)煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity5.酵母表達常用載體煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity6.哺乳動物細胞常用表達載體煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity腺病毒載體系統(tǒng)

煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversityBACK煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity常用的工具酶（toolenzymes）有：1.限制性核酸內(nèi)切酶（resrictionenzymes,restrictionendonadease)2.DNA連接酶（DNAligase)3.逆轉錄酶(reversetranscriptase)6.末端轉移酶(terminaltransferase)以1.和2.最為常用.工具酶現(xiàn)已商品化第四節(jié)分子克隆中常用的工具酶煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity一限制性核酸內(nèi)切酶定義:一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列,并由此切割DNA雙鏈結構的核酸內(nèi)切酶.限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)Luria和Human發(fā)現(xiàn)細菌能將外來的DNA片段在某些專一位點上切斷,從而保證其不被外來噬菌體所感染,而其自身的DNA由于被一種特殊的酶所修飾(甲基化)而得以保護,這種現(xiàn)象叫做限制－修飾.煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名,用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名,用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序.命名HindⅢ屬

種

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離到第一個限制性內(nèi)切核酸酶HindI煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity分類:Ⅰ型:識別和切割位點不固定,隨機Ⅲ型:核酸內(nèi)切酶活性和甲基化活性不分開Ⅱ型:能特異在識別位點處切割DNA.核酸內(nèi)切酶活性和甲基化活性是分開的.最常用！煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversityⅡ型限制性核酸內(nèi)切酶基本特性:特異的識別4~8個核苷酸組成的識別序列,識別序列呈回文結構:兩個順序相同的拷貝在DNA鏈上呈反向排列

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’EcoRⅠ煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity

1.產(chǎn)生5′突出粘性末端(stickyend)EcoRI**********GAATTC******************CTTAAG********5′3′5′3′*********G*********CTTAA

5′3′3′5′—OH—P

AATTC*********G*********5′3′3′5′P

OH—經(jīng)限制酶切割后的位點,DNA斷裂類型:煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity

2.產(chǎn)生3′突出粘性末端PstI**********CTGCAG************************GACGTC**************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*********CTGCA*********G5′3′3′5′OH——PACGTC***********G***********煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity

3.產(chǎn)生平末端(bluntend)AluI*************AGCT**************************TCGA*************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*************AG*************TC5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity影響限制性內(nèi)切酶活性的因素DNA的純度,增加酶量、擴大體積、延長時間DNA的甲基化,選用失去甲基化功能的菌株溫度,一般37,還有25.30.60等分子結構,超螺旋,線性,識別序列兩側限制酶的緩沖液,Mg2+,Tris-Cl,DTT,BSA,NaCl,KCl等

星號活性(staractivity)EcoRⅠ切GAATTCEcoRⅠ*切pupuATpypy或AATT煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity限制性內(nèi)切酶用途:

基因重組過程中切割DNA以獲取目的基因片段,切割載體形成切口,使目的基因能插入載體中.2.限制性片段長度多態(tài)性(RestrictionFragmentLengthPolymorphysms,

RFLP)分析:遺傳病的診斷,法醫(yī)

DNA指紋分析等.3.構建DNA的物理圖譜,基因定位,DNA的同源性分析等等.煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity二DNA連接酶DNA連接酶(Ligase)是一種能夠催化在雙鏈DNA鏈的3′-OH和5′-P之間形成磷酸二酯鍵的酶,可連接互補粘性末端或平端以及缺口修復,不能連接單鏈DNA或裂口常用的是T4DNA連接酶：來源－噬菌體T4感染Ecoli煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity三逆轉錄酶以RNA為模板,逆轉錄成cDNA第一鏈,又稱依賴RNA的DNA聚合酶.(AMV最常用)聚合酶活性:RNA或DNA為模板3’外切酶活性:能降解DNA-RNA雜合鏈中的RNA應用:1.RT-PCR使mRNA逆轉錄成cDNA2.制備探針商品化逆轉錄酶有兩種：

①AMV(禽成髓細胞瘤)②Mc-MLV(鼠白血病病毒).煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity四末端脫氧核苷酸轉移酶(terminaltransferase,TTE)可催化DNA片段上3’-OH端加接脫氧核糖核苷酸(不需模板,但底物至少要3個bp,需Mg2+)常用于同種堿基多聚體接尾反應核素標記DNA片段的3’端

煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity第五節(jié)目的基因和載體連接、轉化、篩選一外源基因與載體的連接粘性末端連接方式:(1)同一限制酶切位點連接

(2)不同限制酶切位點連接煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversityBamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity不同限制酶切位點的連接EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity2.平端連接限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端，直接連接效率低煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity導入大腸桿菌1.原生質體轉化法2.氯化鈣轉化法3.電擊法導入哺乳動物細胞1.顯微注射法2.電穿孔法3.DNA-磷酸鈣共沉淀4.DEAE-葡聚糖轉染法5.病毒感染法6.脂質體介導法7.細胞融合法8.原生質體融合法二重組DNA導入受體菌煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity

轉化就是以質粒作為克隆載體將目的基因導入宿主細胞(感受態(tài))的過程.

感受態(tài)細胞是指細胞處于容易接受外源DNA的狀態(tài).常用CaCl2法制備,過程:

接種細菌振蕩過夜——以約1:100的接種量接入新的20mlLB中—培養(yǎng)至OD600≈0.3-0.4,離心(5K,5’)收集菌體—加入預冷CaCl2(10ml100mM)冰浴20’—離心收集菌體—加入100ul100mM預冷CaCl2混勻—加甘油保存-80度煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity轉化方法:㈠原生質體轉化法除去細胞壁后加外源DNA,經(jīng)吸收恢復再生培養(yǎng),如枯草桿菌㈡化學轉化法(CaCl2法)冰浴30min—42℃90s—冰浴2min—加37℃預熱LB培養(yǎng)45min,取50-200ul/皿涂布,37℃倒置培養(yǎng)過夜,觀察細菌生長情況㈢電穿孔法原理:利用高壓脈沖電場,在宿主細胞表面形成暫時性的微孔,質粒DNA可乘隙而入,脈沖過后,微孔復原.操作更簡單,轉化效率高,不僅無需制備感受態(tài)細胞,而且適用于任何菌株.煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity三.轉化子的篩選與鑒定轉化子,重組子,陽性克隆:都指帶有重組質粒(含目的基因)的菌株煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity利用遺傳標志的表型特征篩選煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity2.β-半乳糖苷酶(LacZ)基因失活篩選法非重組質粒:不含有插入的DNA藍色菌落重組質粒:含有插入的DNA:白色菌落非重組質粒重組質粒煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity(二)根據(jù)重組子的結構特征篩選1)重組子大小鑒別篩選菌落——提取質?！娪?)酶切鑒定菌落——提取質?！p酶切——電泳3)PCR篩選法能與插入基因片斷兩端互補的特異引物,以少量抽提的重組子DNA為模板,進行PCR分析

4)測序煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity原位雜交煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity一疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質,而認識疾病的分子機制.第六節(jié)基因工程和醫(yī)藥煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity二生物制藥基因工程可大量生產(chǎn)天然稀有存在的重要的肽或蛋白質.基因工程可根據(jù)人的意愿設計生產(chǎn)出天然不存在的有重要生物活性的肽或蛋白質.人類基因組計劃及后基因組計劃的成果將為基因工程提供難于估量的廣闊發(fā)展空間.煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進凝血顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成促紅細胞生成素剌激白細胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預防霍亂煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity三基因診斷基因診斷(geneticdiagnosis)是利用分子生物學及分子遺傳的技術和原理,在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變.

發(fā)現(xiàn)并獲得某種疾病的特異性基因是基因診斷的基礎.煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity四基因治療(genetherapy)

基因治療的策略1.基因置換:以正?；蛱鎿Q缺陷基因.一切通過基因水平的操作而達到,治療疾病目的療法.2.基因補償:導入正?；?補償缺陷基因的功能.3.基因失活:用反義核酸封閉有害基因的表達.

定義:煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity

1.目的基因的表達水平太低或難于精確控制.2.目的基因的轉移和表達缺乏足夠的靶向性.3.對基因表達調(diào)控、基因表達產(chǎn)物的功能的認識還很少.目前基因治療面臨的問題煙臺大學藥學院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity補充：多利誕生的過程1.取出第一只成年母羊乳腺的普通細胞,分離基因備用.2.取出第二只母羊未受精的卵細胞,取出基因換上第一只羊乳腺細胞基因(“掉包”),放電激活該卵細胞,使之象正常受精卵一樣進行細胞分裂,直至一定階段,胚胎成熟.3.將成熟的胚胎移植到第