抗菌藥物敏感性試

抗菌藥物敏感性試第1頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一學(xué)習(xí)目標(biāo)

1、了解抗菌藥物敏感性試驗的意義、我國抗菌藥物敏感性試驗應(yīng)遵循的規(guī)則。

2、掌握紙片擴(kuò)散法和E試驗原理，牢記試驗的操作步驟及各步驟中的注意事項，在日常工作中進(jìn)行規(guī)范化的操作。

抗菌藥物敏感性試驗的意義是什么？我國抗菌藥物敏感性試驗應(yīng)遵循哪些規(guī)則？一、基本內(nèi)容

（一）藥敏試驗的意義：1.查出耐藥，減少治療錯誤，便于醫(yī)生選擇個體化療方案、節(jié)省費用。2.進(jìn)行耐藥監(jiān)測，為醫(yī)院感染控制部門提供防治依據(jù)，為經(jīng)驗用藥提供可靠依據(jù)。3.利用耐藥監(jiān)測結(jié)果控制抗菌藥物應(yīng)用，減少耐藥菌株的出現(xiàn)，延長新藥使用壽命。4.為新藥的研究和評估提供有價值的信息。（二）、藥物敏感試驗規(guī)則第2頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一目前世界上通用的規(guī)則是德國和歐洲標(biāo)準(zhǔn)，而我國主要以臨床試驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI），即美國國家實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)的規(guī)則為標(biāo)準(zhǔn)，這個標(biāo)準(zhǔn)主要包括CLSI紙片擴(kuò)散法（M2）和需氧菌稀釋法（M7）。（三）、抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果參照標(biāo)準(zhǔn)1.標(biāo)準(zhǔn)的正確使用M100–即新表M100-S17，每年更新1次；包括M2和M7文件，M2–即紙片擴(kuò)散法(DD)文件M2-A9，M7–即MIC文件M7-A7。M2、M7文件每3年更新一次；使用文件時應(yīng)注意文件是否已更新，避免使用舊文件造成判斷結(jié)果失誤。2.獲得文件的方法如果購買廠家的紙片可向廠家索取標(biāo)準(zhǔn)，每年國際化會議也會頒發(fā)此文件的中心內(nèi)容。（四）、CLSIM-100表內(nèi)容：CLSIM-100表主要包括版本中的更新要點、各版本抗菌藥物分組、M2紙片擴(kuò)散法用的表、M7MIC用的表、M7MIC用的表及詞匯表等內(nèi)容。第3頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一2007年主要更新內(nèi)容有關(guān)“或”的章節(jié)，即同類抗生素能否相互替代的問題；耐藥性的增長及連續(xù)發(fā)生株的測試原則；不適于尿中分離菌的藥物，大環(huán)內(nèi)酯類的說明；革蘭陰性菌及陽性菌的更新部分；質(zhì)量評估和質(zhì)量控制方面的更新。（五）、試驗與報告中抗菌藥物的選擇M-100表將抗菌藥物分成A.B.C.U.O組1、表1和表1A中所列A組藥物被認(rèn)為對特定菌群的常規(guī)的首選試驗組合以及常規(guī)結(jié)果報告中應(yīng)該出現(xiàn)的藥物。2、B組包含一些臨床上重要的，特別是針對醫(yī)院內(nèi)感染的藥物，也可以用于首選試驗。但是，它們只是被選擇性地報告，例如當(dāng)細(xì)菌對A組同類藥物耐藥時，可以選用。其他報告指征可包括以下幾點：特定的標(biāo)本來源(如對腦脊液中的腸道桿菌用三代頭孢菌素或者對泌尿道的分離菌株用TMP/SMZ)；多種細(xì)菌感染；多部位感染；對A組藥物過敏、耐受或無效的病例；為流行病學(xué)調(diào)查目的向感染控制組報告。3、C組包括替代性或補(bǔ)充性抗菌藥物，可在以下情況進(jìn)行試驗：某些單位隱匿局部或廣泛流行的對數(shù)種基本藥物耐藥的菌株；治療對基本藥物過敏的患者；治療少見菌的感染(如氯霉素對沙門菌屬或某些假單胞菌屬)；為流行病學(xué)目的向感染控制組報告。第4頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一4、U組(“泌尿道”)列出了某些僅用于治療泌尿道感染的抗微生物藥(如呋喃妥因和某些喹諾酮類藥物)。除泌尿道，其它感染部位分離的病原菌不用此組藥物進(jìn)行試驗。5、O組(“其它”)對該組細(xì)菌有臨床適應(yīng)癥但一般不允許常規(guī)試驗與報告的藥物。6、Inv組(“研究性”)對該菌群作研究用且尚未經(jīng)FDA批準(zhǔn)的藥物。（六）、試驗操作的基本原則1.臨床標(biāo)本不能直接做藥敏試驗，目的以準(zhǔn)確結(jié)果回報臨床。2.不應(yīng)在同一平板做混合菌藥敏試驗。3.與感染無關(guān)菌株（定植菌）不做藥敏試驗。4.判斷標(biāo)準(zhǔn)：一菌一藥一規(guī)則。第5頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一二、方法分類簡介及標(biāo)準(zhǔn)化操作流程藥敏試驗分為以下實驗方法：紙片擴(kuò)散法、Etest法、瓊脂對倍稀釋法、肉湯對倍稀釋法、儀器法。（一）紙片擴(kuò)散法主要介紹內(nèi)容包括：紙片擴(kuò)散法的原理、培養(yǎng)基的制備、接種物的制備及接種、貼藥敏紙片、孵育與判讀。1、KB法原理：將干燥的浸有一定濃度抗菌藥物的濾紙片放在已接種一定量某種細(xì)菌的瓊脂平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，可在紙片周圍出現(xiàn)無細(xì)菌生長區(qū)，稱抑菌環(huán)。測量抑菌環(huán)的大小，根據(jù)判讀標(biāo)準(zhǔn)即可判定該細(xì)菌對某種藥物的敏感程度。

第6頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一1.培養(yǎng)基制備及種類操作流程圖

注意事項：

1.全程無菌操作

2.濕度控制

3.胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的影響

4.培養(yǎng)基用水

第7頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一培養(yǎng)基種類

1.Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基（非苛氧菌）

2.HTM培養(yǎng)基：其組成成分如下：M-H瓊脂粉；15μɡ/ml牛羥基血紅素；PH7.2-7.4；NCCLS不推薦用M-H巧克力培養(yǎng)基作嗜血桿菌藥敏試驗。（嗜血桿菌）

3.GC瓊脂.此補(bǔ)充品(1升水中加入1.1gL-胱氨酸，0.03g鹽酸鳥嘌呤，3mg鹽酸硫胺，13mg對鞍基苯甲酸，0.01g維生素B12，0.1g輔羧酶，0.25gNAD，1.0g腺嘌呤，10gL-谷氨酰胺，100g葡萄糖，和0.2g硝酸鐵)是在GC瓊脂高壓滅菌后加入的.（淋病奈瑟菌）

4.5－7%脫纖維羊血的M-H瓊脂（鏈球菌）培養(yǎng)基的制作過程中最重要的是厚度，即厚度4mm是最重要的因素。（如圖）

第8頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一2.接種物的制備

1).直接菌落懸液法多用，廣泛

2).生長法少用，局限性

3).注意事項：嗜血桿菌、淋球菌配制菌懸液必須采用巧克力培養(yǎng)基上的菌落作直接懸浮法。菌液濃度應(yīng)嚴(yán)格要求0.5麥?zhǔn)蠁挝?。選取新鮮的純菌落，配置0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，：接種物濁度調(diào)整好后，最好在15分鐘內(nèi)接種，用無菌棉拭子蘸取調(diào)好的菌液，在液面上方管壁處旋轉(zhuǎn)并用力擠壓幾次，擠出多余的接種菌液。用棉拭子在無菌的稍干燥的M-H瓊脂表面劃線接種，再重復(fù)操作兩次，每次將平板轉(zhuǎn)動約60度，保證接種物均勻分布，最后用棉拭子涂抹瓊脂的邊緣。在加含藥的紙片之前，可以將培養(yǎng)皿蓋半開3-5分鐘，但不超過15分鐘，促使表面過多的水分被吸收。

第9頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一1.通過CLSI推薦表選擇藥物，標(biāo)志性藥物不可少，如：FOX-STAPH，CN120-ENTEROCOCCI。紙片順序可做調(diào)整，如：測定E.coli和Klebsiellapneumoniae時CAZ、CTX紙片貼在含酶抑制劑的紙片如AMC旁邊，初步提示是否產(chǎn)ESBLs。2.在接種好的瓊脂平板上貼加紙片注意要點<1>將事先確定的抗微生物藥組合的紙片分貼到接種好菌的瓊脂平板表面。每個紙片應(yīng)與瓊脂表面完全接觸，并且應(yīng)均勻分布，使其中心間距不小于24mm。<2>貼完紙片后，應(yīng)在15分鐘內(nèi)，將平板反轉(zhuǎn)過來，置于35℃孵箱中。注意事項：1.150mm平板所貼紙片不應(yīng)超過12個，100mm的不應(yīng)超過5個，嗜血桿菌要求150mm平板貼紙片不應(yīng)超過9張，100mm平皿貼紙片不應(yīng)超過4張。2.紙片一但接觸了瓊脂表面，就不應(yīng)再挪動位置。3.除嗜血桿菌，淋球菌、鏈球菌、腦膜炎奈瑟氏外，平板不應(yīng)在CO2含量高的空氣中孵育，因為其解釋結(jié)果是根據(jù)普通空氣中的孵育結(jié)果研究出的，而CO2會顯著改變某些藥物的抑菌圈大小。第10頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一5、判讀平板和解釋結(jié)果孵育16-18小時后，檢查每一塊平板，如果平板劃線滿意，接種物準(zhǔn)確無誤，抑菌圈應(yīng)為正圓形，菌落應(yīng)相互融和生長。則可以開始記錄抑菌環(huán)大小。如果出現(xiàn)明顯的單個菌落，說明接種量太少，必須重復(fù)試驗。注意：葡萄球菌或腸球菌應(yīng)在投射光的照射下判讀，變形桿菌屬會攀延生長，應(yīng)讀大的抑菌環(huán)。下圖所示為理想的試驗結(jié)果。第11頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一6、測量工具游標(biāo)卡尺與普通直尺圖中所示為經(jīng)常用到的測量工具，注意用直尺測量時應(yīng)通過紙片的中心，同時盡量貼近平皿；游標(biāo)卡尺只需讀到mm，測量時也應(yīng)盡量貼近平皿。

第12頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一7、KB試驗中常見的錯誤來源KB試驗中常見的錯誤來源有抄錄數(shù)據(jù)時的書寫錯誤，測量抑菌圈直徑的讀數(shù)錯誤，菌株有污染，錯誤的孵育溫度或空氣條件，試驗用培養(yǎng)基的質(zhì)量不合格，尤其厚度，紙片在試驗室取用或貯存的過程中失效，接種菌懸液太濃或太淡，判讀標(biāo)準(zhǔn)錯誤。(二)Etest試驗1.原理：E試驗(Etest)是一種定量的抗生素藥敏測定技術(shù)，此試驗是稀釋法和擴(kuò)散法的結(jié)合產(chǎn)物，可用于在瓊脂培養(yǎng)基上判定某抗生素對微生物的最小抑菌濃度(MIC)，用μg／ml表示。E試驗?zāi)苡眠B續(xù)的MIC數(shù)值直接對抗生素的藥敏試驗結(jié)果進(jìn)行定量。由于E試驗MIC值都來自一個預(yù)先制備且連續(xù)的抗生素濃度梯度，因此它們與常規(guī)的不連續(xù)對倍稀釋法所獲取的MIC值更為精確。盡管E試驗的操作與紙片擴(kuò)散法相似，但它又不同于常規(guī)紙片法。Etest試驗的要點是紙片擴(kuò)散和連續(xù)濃度梯度的結(jié)合，試紙條穩(wěn)定，結(jié)果可靠。2.步驟同紙片擴(kuò)散法包括接種物制備，鋪菌，注意事項：長棉棒和雙平皿。貼條，孵育，讀數(shù)。下圖所示為ETest試驗的主要操作步驟：取出待檢測的ETest試紙條，用兩端帶有粘性膠貼的工具粘取試紙條，將試紙條邊壓邊貼在已經(jīng)鋪好菌液的平皿表面，或用電子取條筆進(jìn)行上述操作。第13頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一第14頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一在貼條過程中，90mm平皿只能貼2條，同時不同的試紙條高濃度的一段應(yīng)該向背；若貼2條含有酶抑制劑的試條應(yīng)將含有酶抑制劑的一端貼在同一側(cè)。貼條注意事項：試條事先恢復(fù)室溫：10分鐘左右。試條的數(shù)量與角度：4-6條、1-2條。貼條的時間：平皿多余水分已經(jīng)消失。試條的方向：高濃度端向外。貼條的動作：平穩(wěn)、流暢、不拖拉。氣泡的處理：盡量向一端趕。3.孵育同K-B法注意孵育時間、環(huán)境溫度及酸堿度。讀數(shù)原則：殺菌劑讀清晰的邊緣見圖1，抑菌劑讀大菌落與小菌落的交界見圖2。變形桿菌讀最小的MIC值，后兩張為含酶抑制劑抗生素的測試結(jié)果。第15頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一

不同菌株的讀數(shù)技巧略有不同，經(jīng)驗非常重要。(三)瓊脂對倍稀釋法1.原理及步驟（瓊脂稀釋法）第16頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一抗生素稀釋梯度不同抗菌藥物對不同的特定細(xì)菌所設(shè)置的抗菌藥物梯度不同，抗生素濃度梯度應(yīng)包含臨床有價值的稀釋濃度其最高濃度應(yīng)高于血液或局部組織液的峰值，最低濃度應(yīng)低于對照菌的MIC值。將配置好的不同濃度的抗菌藥物按預(yù)置比例加入肉湯或已平衡溫度（45-55℃）瓊脂液中，使其成為不同濃度梯度測試系列。將待測菌配制成1.2×107/ml濃度。用多頭接種器或加樣器在每一濃度梯度的肉湯或瓊脂中加入菌懸液使其達(dá)最終濃度（肉湯稀釋法為105/ml，瓊脂稀釋法為104/點。）置35℃培養(yǎng)18-24小時，觀察結(jié)果。2.結(jié)果判讀以最低抗菌藥物濃度仍能抑制細(xì)菌生長為該抗菌藥物對特定菌的最低抑菌濃度（MIC）。將最低抑菌濃度和低兩個梯度培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種到瓊脂或血平皿，置35℃培養(yǎng)18-24小時，觀察有無細(xì)菌生長，最低抗菌藥物濃度不生長細(xì)菌的濃度為最低殺菌濃度