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文檔簡介
二、染色體的結構和組成1、染色體概述
染色體(chromosome)之所以稱為染色體,是因為它能被堿性染料染色,而細胞的其他組成分都不能被堿性染料染色的緣故。細胞內的DNA主要在染色體上,所以染色體是遺傳物質的主要載體。染色體由DNA和蛋白質兩大部分組成。目前一頁\總數一百頁\編于十六點人類的全部染色體目前二頁\總數一百頁\編于十六點人類基因組各條染色體中堿基對數量和功能基因數量對照表(基因組是細胞內單套染色體及其上的基因)目前三頁\總數一百頁\編于十六點染色體存在于真核細胞內的核仁內,呈線性結構。細胞分裂時,每條染色體都復制生成一條與母鏈完全一樣的子鏈,形成同源染色體對。染色體只有在細胞有絲分裂過程中才可見,而在分裂間期,則以松散的染色質形式存在于胞核中。原核細胞和真核細胞染色體在結構和組成上均有差別。原核細胞一般情況下只含一條染色體,基因序列與其編碼的蛋白質序列基本呈線性對應。細菌DNA是一條相對分子質量在109左右共價閉合雙鏈分子,通常也稱為染色體。
目前四頁\總數一百頁\編于十六點目前五頁\總數一百頁\編于十六點2、真核細胞染色體的組成
2.1染色質和核小體
染色質的電子顯微鏡圖顯示出由核小體組成的念珠狀結構,可以看到由一條細絲連接著的一連串直徑為10nm的球狀體。核小體是由H2A、H2B、H3、H4各兩個分子生成的八聚體和由大約200bpDNA組成的。
目前六頁\總數一百頁\編于十六點核小體單元的產生目前七頁\總數一百頁\編于十六點雙螺旋DNA經過一系列包裝成為染色體的過程30nm的染色體結構目前八頁\總數一百頁\編于十六點2.2染色體中的核酸組成同類生物不同種屬之間DNA總量變化很大橫坐標為C值(value-paradox),指一種生物單倍體基因組DNA的總量。2.2.1不同的生物DNA的量不同目前九頁\總數一百頁\編于十六點編碼每種生物所需DNA的最低值生物越高等所需DNA的量越大目前十頁\總數一百頁\編于十六點2.2.2真核細胞的DNA序列大致可分為3類不重復序列
中度重復序列
高度重復序列--衛(wèi)星DNA編碼rRNA的基因上18S/5.8S/28S/間隔區(qū)組成的單位在DNA鏈上串聯重復許多次(中度重復序列)目前十一頁\總數一百頁\編于十六點鼠染色體經原位雜交放射自顯影后示衛(wèi)星DNA的位置(黑色區(qū)域)目前十二頁\總數一百頁\編于十六點2.3染色體中的蛋白質染色體上的蛋白質包括組蛋白和非組蛋白2.3.1組蛋白(histonesprotein
)組蛋白是染色體的結構蛋白,它與DNA組成核小體。通??梢杂?mol/LNaCl或0.25mol/L的HCl/H2SO4處理使組蛋白與DNA分開。組蛋白分為H1、H2A、H2B、H3及H4。目前十三頁\總數一百頁\編于十六點H1、H2A、H2B、H3及H4。這些組蛋白都含有大量的賴氨酸和精氨酸,其中H3、H4富含精氨酸,H1富含賴氨酸;H2A、H2B介于兩者之間。目前十四頁\總數一百頁\編于十六點組蛋白的一般特性:進化上的極端保守性——在物種進化的歷程中沒有出現太大的變化。無組織特異性(組織特異性:特定的生物體組織中含有特定的某種組蛋白)肽鏈上氨基酸分布的不對稱性
(堿性氨基酸和酸性氨基酸在其肽鏈上不是均勻或對稱分布)組蛋白的修飾作用——被活性基團修飾。富含賴氨酸的組蛋白H5。目前十五頁\總數一百頁\編于十六點2.3.2非組蛋白(non-histoneprotein,NHP
)是指染色體中組蛋白以外的其它蛋白質,它是一大類種類繁雜的各種蛋白質的總稱。
非組蛋白的一般特性:非組蛋白的多樣性。非組蛋白的量大約是組蛋白的60%~70%,但它的種類卻很多,約在20-100種之間,其中常見的有15-20種。
非組蛋白的組織專一性和種屬專一性。
目前十六頁\總數一百頁\編于十六點幾類常見的非組蛋白HMG蛋白(highmobilitygroupprotein)。這是一類能用低鹽(0.35mol/LNaCl)溶液抽提、能溶于2%的三氯乙酸、相對分子質量較低的非組蛋白,相對分子質量都在3.0×104以下。DNA結合蛋白(與DNA結合緊密)。用2mol/LNaCl除去全部組蛋白和70%非組蛋白后,還有一部分蛋白必須用2mol/LNaCl和5mol/L尿素才能與DNA解離。這些蛋白分子量較低,約占非組蛋白的20%,染色質的8%。
A24非組蛋白。目前十七頁\總數一百頁\編于十六點3、原核生物與真核生物染色體DNA比較1.原核生物中一般只有一條染色體且大都帶有單拷貝基因,只有很少數基因〔如rRNA基因〕是以多拷貝形式存在;2.
整個染色體DNA幾乎全部由功能基因與調控序列所組成;3.幾乎每個基因序列都與它所編碼的蛋白質序列呈線性對應狀態(tài)。
目前十八頁\總數一百頁\編于十六點4、原核生物基因組從基因組的組織結構來看:結構簡練存在轉錄單元有重疊基因目前十九頁\總數一百頁\編于十六點目前二十頁\總數一百頁\編于十六點親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下,分別以各單鏈DNA分子為模板,聚合與自身堿基可以互補配對的游離的dNTP,合成出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過程?!駨椭谱樱≧eplicon);又稱復制單位或復制元DNA中含有一定復制起點和復制終點的復制單位1.3萬~90萬不等三、DNA的復制目前二十一頁\總數一百頁\編于十六點●復制體(Replisome)復制叉處的許多酶和蛋白組成的復合體,協同作用合成DNA目前二十二頁\總數一百頁\編于十六點DNA復制在細胞周期的S期E.coli37℃0.5h105bp/minmammaliancell500-5000bp/min目前二十三頁\總數一百頁\編于十六點3.1DNA的半保留復制
(Semi-ConservationReplication)1958Meselson-stahl設計的CsCl超離心試驗證實了
DNA復制的這一特性概念:復制過程中各以雙螺旋DNA的其中一條鏈為模
板合成其互補鏈,新生的互補鏈與母鏈構成子
代DNA分子目前二十四頁\總數一百頁\編于十六點15N標記實驗·細胞生長在15N標記培養(yǎng)基中·轉入正常N源培養(yǎng)基中·分離各代DNA·分析各代DNA的浮力密度15N標記DNA未標記DNACsCL密度梯度離心浮力密度N15-DNA1.742g/mlN15-N14-DNA1.717g/mlN14-DNA1.710g/ml目前二十五頁\總數一百頁\編于十六點
3.2復制起點、方向和速度復制起點(復制原點)復制開始處DNA分子的特定位置——復制叉原核生物(Prokaryote):單復制起點即--整個染色體只有一個復制單位(復制子)
目前二十六頁\總數一百頁\編于十六點目前二十七頁\總數一百頁\編于十六點領頭鏈leadingstrand——合成方向與復制叉解鏈方向相同,并可連續(xù)合成的子鏈。隨從鏈laggingstrand——合成方向與復制叉解鏈方向相反,并且是不連續(xù)合成的子鏈。
岡崎片段okazakifragment——在DNA復制過程中,隨從鏈上初合成的不連續(xù)的DNA片段。半不連續(xù)性復制——在DNA復制過程中,領頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制。
目前二十八頁\總數一百頁\編于十六點真核生物(Eukaryote):多復制起點即一個genome中有多個復制單位目前二十九頁\總數一百頁\編于十六點Replicationfork目前三十頁\總數一百頁\編于十六點復制叉(Replicationfork):染色體中參與復制的活性區(qū)域,即復制正在發(fā)生的位點
復制方向(復制過程的順序性)復制眼(replicationeye):電子顯微鏡下觀察正在復制的DNA,復制的區(qū)域形如一只眼睛目前三十一頁\總數一百頁\編于十六點真核生物的多復制子多個復制眼目前三十二頁\總數一百頁\編于十六點目前三十三頁\總數一百頁\編于十六點單雙向復制取決于起點處有一個還是兩個復制叉
單向復制
雙向復制目前三十四頁\總數一百頁\編于十六點復制速度3H標記10min后復制的長度取消標記后10min復制的長度標記和取消標記后兩個方向復制的長度相等雙向等速復制目前三十五頁\總數一百頁\編于十六點3.3DNA復制的多模式單起點、單方向(原核)多起點、單方向(真核)單起點、雙方向(原核)多起點、雙方向(真核)3.3.1線性DNA雙鏈的復制目前三十六頁\總數一百頁\編于十六點
(1)Theta型復制雙鏈環(huán)狀DNA的復制眼可以形成一種θ結構,形狀像希臘字母θ,因而叫θ型復制。3.3.2環(huán)狀DNA雙鏈的復制目前三十七頁\總數一百頁\編于十六點熱鏈(標記鏈)冷鏈(非標記鏈)目前三十八頁\總數一百頁\編于十六點
AreplicationeyeformsathetastructureincircularDNA.目前三十九頁\總數一百頁\編于十六點(2)滾環(huán)型復制(rollingcirclereplication)單向復制的特殊方式大多數以對稱方式進行——即兩條鏈同時復制。但也有一定時期內DNA只復制一條鏈的情況。由于復制時產生的滾環(huán)結構形狀象σ,又稱σ復制
病毒、細菌因子
目前四十頁\總數一百頁\編于十六點(3)置換式(Displacementform)又稱D環(huán)復制
兩條鏈的合成高度不對稱,一條鏈迅速合成出互補鏈,另一條則形成游離的單鏈環(huán)(D-環(huán))線粒體和葉綠體DNA的復制方式目前四十一頁\總數一百頁\編于十六點3.4原核生物DNA復制的特點(大腸桿菌:雙鏈環(huán)狀)?四個9bp的重復序列dnaA結合位點?三個13bp的重復序列DNA復制的起始區(qū)目前四十二頁\總數一百頁\編于十六點目前四十三頁\總數一百頁\編于十六點(1)DNA雙螺旋的解旋在多種蛋白質及酶的參與下DNA雙鏈解開,形成復制叉的復雜過程。重要的酶和蛋白質:目前四十四頁\總數一百頁\編于十六點(2)DNA復制的引發(fā)DNARNA引物新DNA鏈先導鏈需一個引物RNA鏈,而滯后鏈需要若干引物RNA。引發(fā)前體引發(fā)酶共同作用引發(fā)體RNA引物新DNA鏈目前四十五頁\總數一百頁\編于十六點目前四十六頁\總數一百頁\編于十六點(3)DNA復制的終止目前四十七頁\總數一百頁\編于十六點
DNA聚合酶(DNApolymerase)是細胞復制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶,以DNA為復制模板,將DNA由5'端點開始復制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具備模板、引物、dNTP等的情況下)及其相輔的活性。DNA聚合酶目前四十八頁\總數一百頁\編于十六點目前四十九頁\總數一百頁\編于十六點3.5真核生物DNA復制的特點目前五十頁\總數一百頁\編于十六點3.6DNA復制的調控復制叉數量決定復制起始頻率,復制起始頻率受控于蛋白質和RNA。目前五十一頁\總數一百頁\編于十六點目前五十二頁\總數一百頁\編于十六點目前五十三頁\總數一百頁\編于十六點四、DNA的修復(DNArepairing)
是細胞對DNA受損傷后的一種反應,這種反應可能使DNA結構恢復原樣,重新能執(zhí)行它原來的功能。但有時并非能完全消除DNA的損傷,只是使細胞能夠耐受DNA的損傷而可以繼續(xù)生存。也許這些未能完全修復而留存下來的損傷會在適合的條件下顯示出來(如細胞的癌變等),但如果細胞不具備這些修復功能,就無法對付經常發(fā)生的DNA損傷事件,細胞就不能生存。目前五十四頁\總數一百頁\編于十六點DNA分子的自發(fā)性損傷1、DNA復制中的錯誤以DNA為模板按鹼基配對進行DNA復制是一個嚴格而精確的事件,但也不是完全不發(fā)生錯誤的。2、DNA的自發(fā)性化學變化生物體內DNA分子可以由于各種原因發(fā)生變化,至少有:①堿基的異構互變;②堿基的脫氨基作用;③脫嘌呤與脫嘧啶;④堿基修飾與鏈斷裂
目前五十五頁\總數一百頁\編于十六點物理因素引起的DNA損傷
1、紫外線引起的DNA損傷當DNA受到最易被其吸收波長(~260nm)的紫外線照射時,主要是使同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價鍵連成二聚體。2、電離輻射引起的DNA損傷電離輻射損傷DNA有直接和間接的效應,直接效應是DNA直接吸收射線能量而遭損傷;間接效應是指DNA周圍其他分子(主要是水分子)吸收射線能量產生具有很高反應活性的自由基進而損傷DNA。損傷包括:①堿基變化;②脫氧核糖變化;③DNA鏈斷裂;④交聯。目前五十六頁\總數一百頁\編于十六點化學因素引起的DNA損傷1、烷化劑對DNA的損傷①堿基烷基化;②堿基脫落;③斷鏈;④交聯2、堿基類似物、修飾劑對DNA的損傷
如:人工可以合成一些堿基類似物用作促突變劑或抗癌藥物,如5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、2-氨基腺嘌呤(2-AP)等。還有一些人工合成或環(huán)境中存在的化學物質能專一修飾DNA鏈上的堿基或通過影響DNA復制而改變堿基序列,例如亞硝酸鹽能使C脫氨變成U,經過復制就可使DNA上的G-C變成A-T對。目前五十七頁\總數一百頁\編于十六點目前五十八頁\總數一百頁\編于十六點DNA損傷的修復機制:(一)錯配修復(mismatchrepair):在含有錯配堿基的DNA分子中,使正常核苷酸序列恢復的修復方式。修復的過程是:識別出正確的鏈,切除掉不正確的部分,然后通過DNA聚合酶和DNA連接酶的作用,合成正確配對的雙鏈DNA。目前五十九頁\總數一百頁\編于十六點1、參與錯配修復的酶與蛋白質Dam甲基化酶:使5’-GATC序列中的腺苷酸甲基化,使發(fā)生錯配時修復。
MutH、MutL、MutS蛋白:DNA錯配修復蛋白解螺旋酶Ⅱ;DNA聚合酶Ⅲ;外切酶Ⅰ、Ⅹ、Ⅶ;RecJ核酸酶:作用于單鏈DNA,沿5′→3′方向催化去除單磷酸脫氧核苷酸。DNA連接酶(PolⅢ);DNA復制所需的一種聚合酶。SSB:一種單鏈結合蛋白,可以牢牢地結合在單鏈DNA上,這不但可避免拆開的DNA雙鏈再合攏,也可保護復制中的DNA單鏈部分不被核酸酶降解。
目前六十頁\總數一百頁\編于十六點MutS識別并結合于堿基錯配處MutH-MutL二聚體結合后沿兩個方向移動,形成DNA環(huán),直至遭遇半甲基化的CTAG。MutH在CTAG的5’-端切開一個切口,核酸外切酶Ⅰ、Ⅶ沿3’→5’方向切除含配錯堿基的新鏈DNA聚合酶Ⅲ補缺,DNA連接酶連接切口。高度耗能的錯配修復錯配目前六十一頁\總數一百頁\編于十六點目前六十二頁\總數一百頁\編于十六點(二)堿基的切除修復(base-excisionrepair)修復由于堿基變化引起的受損核苷酸。a、堿基脫氨反應b、核苷酸脫嘌呤反應目前六十三頁\總數一百頁\編于十六點(二)堿基的切除修復(base-excisionrepair)(a)DNA糖基化酶切除損傷的堿基產生無堿基酸(b)無堿基核酸內切酶無堿基酸處切開產生切口。(c)DNA聚合酶Ⅰ將無堿基酸切除并填補缺口。(d)DNA連接酶連接切口。AP位點目前六十四頁\總數一百頁\編于十六點(三)核苷酸
的切除修復DNA解螺旋酶目前六十五頁\總數一百頁\編于十六點(五)重組修復又叫復制后修復:發(fā)生在復制之后。復制時,跳過損傷部位,新鏈產生缺口由母鏈彌補,然后用新合成的序列補上母鏈空缺。原損傷部位并沒有切除,但在后代逐漸稀釋。目前六十六頁\總數一百頁\編于十六點(六)DNA的直接修復目前六十七頁\總數一百頁\編于十六點目前六十八頁\總數一百頁\編于十六點1、形成嘧啶二聚體2、光復合酶結合于損傷部位3、酶被可見光激活4、修復后酶被釋放DNA紫外線損傷的光復合酶修復目前六十九頁\總數一百頁\編于十六點目前七十頁\總數一百頁\編于十六點(七)SOS反應和誘導修復(易錯修復)SOS反應:細胞DNA受到嚴重損傷或DNA復制系統(tǒng)受到抑制的緊急狀態(tài)下,為求生存而出現的應急反應。SOS反應包括:避免差錯的修復能力增強誘導產生無校正功能的DNA聚合酶合成抑制細胞分裂SOS反應是生物在不利環(huán)境中求得生存的一種基本功能。對原核生物它產生高變異,對高等動物則是致癌的。目前七十一頁\總數一百頁\編于十六點五、DNA重組與轉座5.1DNA重組5.1.1概念:是指由于不同DNA鏈的斷裂和連接而產生的DNA片段的交換和重新組合,形成新的DNA分子的過程。5.1.2意義:重組是遺傳學的靈魂,沒有重組就沒有生物的進化;沒有重組也就沒有現代的分子克隆技術。目前七十二頁\總數一百頁\編于十六點5.2DNA重組的類型5.2.1同源重組(HomologousRecombination)5.2.2位點特異性重組(Site-specificRecombination)目前七十三頁\總數一百頁\編于十六點一、概述1、定義:兩個DNA分子同源序列(指從某一共同祖先經過趨異進化而形成的不同序列。)之間進行的重組2、條件:(1)兩個DNA分子有同源序列
(相關的酶可以用任何一對同源序列為底物)(2)兩個DNA分子必須緊密接觸3、發(fā)生:真核生物:非姐妹染色單體交換相對應的區(qū)域。原核生物:依賴RecA蛋白(重組蛋白類),并形成Holliday結構。(見下圖)5.2.1同源重組(HomologousRecombination)目前七十四頁\總數一百頁\編于十六點切口交叉封口鏈位移彎曲兩臂旋轉切開相反鏈切開同一鏈Holiday模型(1964年,美國)
目前七十五頁\總數一百頁\編于十六點二、大腸桿菌同源重組的分子基礎(一)RecA1、作用:可促進單鏈同化或單鏈吸收RecA具有使DNA單鏈置換雙鏈中同源鏈的能力2、單鏈同化發(fā)生的三個條件(1)其中一個DNA必須存在單鏈區(qū)(2)其中一個DNA必須有一個自由3’末端(3)此單鏈區(qū)和3’末端必須位于兩分子之間互補的區(qū)域內(二)RecBCD復合體1、酶的活性:(1)核酸酶(2)解旋酶(3)ATPase2、作用:在Chi位點(RecBCD
的靶序列)處產生含3ˊ游離未端單鏈.(見下圖)目前七十六頁\總數一百頁\編于十六點目前七十七頁\總數一百頁\編于十六點(三)Chi位點——RecBCD識別的靶位點5'GCTGGTGG3'3'CGACCACC5'是重組頻率較高的部位E.coli中每隔約5~10kb有一個拷貝目前七十八頁\總數一百頁\編于十六點Holliday結構的形成:1.同源序列排列在一起;2.酶切。通過核酸酶和RecBCD蛋白復合體的作用在一對同源DNA上產生切口;3.入侵。含有3’端切口的ssDNA(singlestrandDNA)被recA蛋白包裹形成recA蛋白-ssDNA細絲;RecA-ssDNA細絲尋找相對的DNA雙螺旋上的相應序列。4.游離端交叉連接,形成Holliday結構5.通過分支遷移產生異源雙鏈DNA。6.空間重排。十字型兩臂旋轉180度7.解離(兩種不同方式)8.修補連接目前七十九頁\總數一百頁\編于十六點基因敲除技術(Geneknockouttechnology)——同源重組的應用是80年代后期,應用DNA同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術。是指對一個結構已知但功能未知的基因,從分子水平上設計實驗,將該基因去除,或用其它順序相近基因取代,然后從整體上觀察實驗動物,推測相應基因的功能。目前八十頁\總數一百頁\編于十六點5.2.2位點特異性重組(Site-specificRecombination)不依賴于DNA順序的同源性,而依賴于能與某些酶相結合的特異的DNA序列的存在。整合的過程(1)具有對特異性DNA強烈親和力的Int與attP和attB位點結合。(2)Int的拓撲異構酶活性,使兩條雙鏈各自斷開一條單鏈,瞬間旋轉然后交換連接。(3)同時在另兩條單鏈之間發(fā)生同樣的斷裂重接,從而完成雙鏈間的重組。目前八十一頁\總數一百頁\編于十六點5.3DNA的轉座(Transposition)基因組是相對穩(wěn)定的,基因組中的序列通常處于恒定的位置。因此,我們可以通過構建遺傳圖譜(geneticmap)來鑒定已知基因的基因座(基因在染色體上所占的位置
)。在分子水平上,每個個體基因組之間的差異主要由重組引起,但轉座元件(transposableelement)或轉座子(transposons)的存在也可以造成基因組的改變。染色體上的基因座,上方是p臂,下方是q臂。
目前八十二頁\總數一百頁\編于十六點5.3.1DNA轉座的概念DNA的轉座又叫移位,是指DNA從染色體的一個位置跳到另一個位置,甚至從一條染色體跳到另一條染色體。是由可移位因子介導的遺傳物質的重排現象。目前八十三頁\總數一百頁\編于十六點5.3.2轉座子的概念及發(fā)現◆轉座子(transposon或transposableelement,Tn)是基因組內相對獨立的、可移動序列,它們不必借用噬菌體或質粒的形式就可以從基因組的一個部位直接轉移到另一個部位,這個過程稱為轉座.(transposition)?!艮D座子每次移動時攜帶著轉座必需的基因一起在基因組內躍遷,所以轉座子又稱跳躍基因(jumpinggene)。目前八十四頁\總數一百頁\編于十六點◆轉座子是基因組的正常組成成分,不以獨立的形式存在(如噬菌體或質粒DNA)。轉座的發(fā)生不依賴于轉座子和靶位點之間任何的序列同源性,在基因組內由一個部位直接轉移到另一個部位。◆轉座以很低的頻率發(fā)生,而且轉座子的插入是隨機的?!艮D座子有時插入到一個結構基因或基因調節(jié)序列內,引起基因表達的改變。目前八十五頁\總數一百頁\編于十六點轉座子也可以引起基因組序列的重排,它們的移動也和進化有關轉座元件首先是由BarbaraMcClintock于40年代在玉米的遺傳學研究中發(fā)現的,她稱之為控制元件(controllingelement),因為它不僅能夠在基因組內轉移,而且還能夠改變基因的活性并引起功能的改變。現在認為轉座子存在于地球上所有的生物。目前八十六頁\總數一百頁\編于十六點目前八十七頁\總數一百頁\編于十六點5.3.3轉座子的分類和結構特征最簡單的轉座子被稱為插入序列IS(insertionsequences,IS)。不含有任何宿主基因,IS元件是細菌染色體和質粒的正常組成部分。最早被鑒定的轉座元件是細菌操縱子中的自主插入序列。這種插入阻止
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