第十一章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物制藥演示文稿

第十一章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物制藥演示文稿目前一頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)優(yōu)選第十一章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物制藥目前二頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)1、成纖維細(xì)胞型細(xì)胞細(xì)胞大致呈梭形或不規(guī)則形。成群細(xì)胞呈現(xiàn)放射狀、旋渦狀等形式。多數(shù)細(xì)胞之間排列疏散，有較大的細(xì)胞間隙。成纖維細(xì)胞存在于肌肉、皮膚和骨骼中，代表有心肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞等。目前三頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)2、上皮型細(xì)胞細(xì)胞特點(diǎn)是：扁平狀，形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞貼壁后呈三角形及不規(guī)則扁平的多角形，中央有扁圓形核，生長時(shí)彼此緊密連接成單層細(xì)胞。因?yàn)橄嗷頂D而呈現(xiàn)“鋪路石狀。代表有皮膚的表皮細(xì)胞、消化管與呼吸道的上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、消化腺上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。目前四頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)3、游走型細(xì)胞細(xì)胞特點(diǎn)是：呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。代表有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。目前五頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)4、多形型細(xì)胞多形型細(xì)胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞。多形型細(xì)胞不常見，只有某些像神經(jīng)組織細(xì)胞等難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的，才可歸于多形細(xì)胞。體外培養(yǎng)呈現(xiàn)多形型細(xì)胞的細(xì)胞最常見的是神經(jīng)原細(xì)胞。目前六頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)接觸抑制與密度抑制接觸性抑制(Contactinhibition)是某些動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的生長特性之一。是指由于細(xì)胞相互接觸而抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的現(xiàn)象由于這個(gè)特性，正常細(xì)胞并不會(huì)相互重疊，而是呈單層細(xì)胞生長。密度抑制(Densityinhibition)細(xì)胞接觸匯合成片后，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍能進(jìn)行增殖分裂。但是當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度后，營養(yǎng)相對(duì)缺乏，代謝產(chǎn)物增多，發(fā)生密度抑制現(xiàn)象目前七頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件1、嚴(yán)格的無菌技術(shù):細(xì)菌\真菌\支原體\病毒\交叉污染2、培養(yǎng)基對(duì)于營養(yǎng)要求非常苛刻，氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽、輔酶、激素、生長因子等。包括：天然、合成、無血清培養(yǎng)基三種。（1）天然培養(yǎng)基動(dòng)物血清（胎牛血清、小牛血清）、組織提取液、雞胚胎汁等。優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)價(jià)值高缺點(diǎn)：成分復(fù)雜、來源有限、成本較高目前八頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)血清的生物功能1、提供基本營養(yǎng)：氨基酸、微生物、無機(jī)鹽、脂類、核酸等2、提供激素及各種生長因子：胰島素、腎上腺素、類固醇、成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子等3、提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白可以攜帶重要的低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶微生物、脂肪和激素，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵等4、提供保護(hù)作用：如通過促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷，如血清蛋白可以增加培養(yǎng)基的黏度，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷，此外血清還提供一些微量元素和離子，防止細(xì)胞代謝中毒，如銫和硒等。目前九頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)（2）合成培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn)：成分已知，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行控制。缺點(diǎn)：無法替代一些未知成分。解決途徑：合成培養(yǎng)基中添加小牛血清，彼此互補(bǔ)。意味著合成培養(yǎng)基都是無血清培養(yǎng)基。目前常用的合成培養(yǎng)基：MEM、DMEM、RPMI1640、F12、M199等.MEM培養(yǎng)基：厄爾利（Earle）于1951年開發(fā)成功。含有少量氨基酸、維生素、谷氨酰胺以及必須的無機(jī)鹽，組成簡單。DMEM培養(yǎng)基：由杜爾貝科（Dulbecco）等在MEM培養(yǎng)基基礎(chǔ)上研制而成，增加了各已有成分的含量，同時(shí)又根據(jù)葡萄糖高低分為高糖型（4,500mg/L）和低糖型（1,000mg/L）。目前十頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)（3）無血清培養(yǎng)基血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)：含有豐富的利于細(xì)胞生長的成分血清培養(yǎng)基缺點(diǎn)：（1）動(dòng)物血清來源有限，價(jià)格高，不宜大量使用。（2）動(dòng)物血清成分復(fù)雜且成分不穩(wěn)定，使生長過程不易檢測控制。（3）雖然血清對(duì)細(xì)胞生長有效，但會(huì)對(duì)后期培養(yǎng)產(chǎn)物的分離、提純以及檢測造成一定困難。無血清培養(yǎng)基(Serumfreemedium,SFM)是不含血清的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加組分組成?；A(chǔ)培養(yǎng)基較常用的是DMEM、F12培養(yǎng)基。添加組分主要包括：細(xì)胞外基質(zhì)、生長因子、結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、酶抑制劑等。目前十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件3、其他溶液（1）平衡鹽溶液（Balancedsaltsolution，BSS）主要由無機(jī)鹽組成，具有維持細(xì)胞滲透壓、調(diào)控培養(yǎng)液酸、堿度平衡的功能。例如：Hanks液，注：酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為pH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。（2）培養(yǎng)基pH調(diào)整液大部分合成培養(yǎng)液都呈微酸性。常用pH調(diào)整液有：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶液、HEPES液等。HEPES是一種非離子兩性緩沖液，其在pH7.2-7.4范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力。中文名：4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸。目前十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)（3）細(xì)胞消化液從組織塊消化分散得到單個(gè)細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)分散細(xì)胞代表：胰蛋白酶溶液，水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，加血清終止反應(yīng)。乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）消化液：解離細(xì)胞,兩者常結(jié)合使用，增加效果。（4）抗生素溶液防止微生物污染。常用抗生素有青霉素、鏈霉素、卡那霉素、制霉菌素等。目前十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)目前十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件4、培養(yǎng)條件影響動(dòng)物細(xì)胞體外生長的因素包括生物因素、化學(xué)因素、物理因素。生長條件的控制主要包括溫度、pH、滲透壓、氣體等。溫度：人類和哺乳類動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜溫度為36.5±5℃。pH：哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)pH值范圍為。滲透壓：細(xì)胞在高滲透壓或低滲透壓溶液中會(huì)發(fā)生皺縮或腫脹，甚至破裂。BSS溶液。氣體：細(xì)胞的生長代謝離不開氣體，主要包括O2和CO2，二氧化碳培養(yǎng)箱很重要。目前十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件5、培養(yǎng)工具1923年卡雷爾（Carrel）（法國醫(yī)學(xué)家、生物學(xué)家，1912年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）設(shè)計(jì)了用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的卡式培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)雞胚心肌組織獲得成功。培養(yǎng)瓶的形狀主要是適合細(xì)胞貼壁生長和顯微鏡觀察的扁平形狀。培養(yǎng)瓶主要有高硼硅玻璃培養(yǎng)瓶與聚苯乙烯塑料培養(yǎng)瓶。目前十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)可以分為貼壁培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)三大類。1、貼壁培養(yǎng)：細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：容易更換培養(yǎng)液；容易采用灌注式培養(yǎng)、不需過濾系統(tǒng)；同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液、適用于所有類型細(xì)胞。缺點(diǎn)：擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難、投資大；占地面積大；不能有效監(jiān)測細(xì)胞的生長。（1）貼壁材料要求：具有親水性、正電荷。常用材料：硅硼酸玻璃（卡氏培養(yǎng)瓶等）、聚苯乙烯（96孔培養(yǎng)板等）對(duì)微載體而言還要求具一定三維結(jié)構(gòu)。目前十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式（2）貼附生長過程游離期：接種的細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮態(tài)。吸附期：不同類型的細(xì)胞的貼壁時(shí)間有所差異，多數(shù)細(xì)胞都可在24小時(shí)內(nèi)貼壁。繁殖期：懸浮細(xì)胞貼壁后經(jīng)過一段停滯后開始分裂。隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，細(xì)胞間開始接觸并連接成片。出現(xiàn)接觸性抑制。退化期：細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶壁，隨著營養(yǎng)物的消耗和代謝物的積累，密度抑制現(xiàn)象出現(xiàn)，細(xì)胞開始退化。如不及時(shí)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞會(huì)從瓶壁上脫落死亡。目前十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)細(xì)胞貼壁過程目前十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式2、固定化培養(yǎng)可以采用類似植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)的方法對(duì)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行固定化培養(yǎng)。具有細(xì)胞生長密度高、抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞易于產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物分離純化。固定化方法與植物細(xì)胞類似。3、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在反應(yīng)器中自由懸浮生長。主要用于非貼壁依賴型細(xì)胞培養(yǎng)，雜交瘤細(xì)胞、血液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，某些腫瘤細(xì)胞等屬于此類細(xì)胞。貼壁型細(xì)胞貼附在微載體上或者包裹在微囊中后可以接種在適當(dāng)生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)。目前二十頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)1、培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法1923年，卡雷爾（Carrel）設(shè)計(jì)成功卡氏瓶，可以保證動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境和生長空間。培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法是目前動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)的主要方法之一。目前二十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)2、培養(yǎng)板培養(yǎng)法（微量培養(yǎng)法）現(xiàn)代體外培養(yǎng)技術(shù)最為常用的方法之一?；疽c(diǎn)：將培養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)，然后在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。常用的培養(yǎng)板有6孔、24孔、96孔培養(yǎng)板。目前二十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)3、灌注小室培養(yǎng)法1912年由伯羅設(shè)計(jì)了一種簡單的灌注小室培養(yǎng)模型。基本要點(diǎn)：將細(xì)胞接種于一個(gè)由上下兩個(gè)蓋玻片（分別構(gòu)成上壁與下壁）與一金屬圈（構(gòu)成側(cè)壁）密封圍成的小室內(nèi)，保持在一定條件下培養(yǎng)。在小室的側(cè)面分別有液體流入和流出的開口，供新鮮培養(yǎng)液流入和舊培養(yǎng)液排出。顯著特點(diǎn)：營養(yǎng)液可以循環(huán)供應(yīng)目前二十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)4、轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法1933-1934年，蓋爾（Gey）和劉易斯（Lewis）建立了旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)方法，將培養(yǎng)物接種于一管狀培養(yǎng)器皿中，再將其固定在一可以旋轉(zhuǎn)的裝置上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)方法克服了靜置培養(yǎng)的不足，例如：細(xì)胞生長環(huán)境不均勻、不利于營養(yǎng)的吸收等，培養(yǎng)物可以交替地接觸培養(yǎng)液和氣體環(huán)境，利于細(xì)胞或組織生長。目前二十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)接種組織塊直接長出單層細(xì)胞或?qū)⒔M織分散成單個(gè)細(xì)胞再進(jìn)行培養(yǎng)，在首次傳代前的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)（Primaryculture）。一般持續(xù)1-4周。在這個(gè)階段，細(xì)胞有分裂但不旺盛。細(xì)胞多呈二倍體核型，這樣的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞（Primarycell）。優(yōu)點(diǎn)：1、組織和細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，在一定程度上能反映體內(nèi)的形態(tài)學(xué)特征。2、在供體來源充分、生物學(xué)條件穩(wěn)定的情況下，原代細(xì)胞是很好的實(shí)驗(yàn)材料，例如藥物測試、研究細(xì)胞分化等。目前二十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)1、組織塊原代培養(yǎng)組織塊原代培養(yǎng)是比較常用的簡易的原代培養(yǎng)方法，也是早期動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法。以培養(yǎng)瓶培養(yǎng)為例：（1）剪刀剪碎組織形成1mm2的組織塊，用吸管吸出組織塊一一放入培養(yǎng)瓶內(nèi)，一般每小塊間隔為厘米，使其均勻貼在培養(yǎng)瓶的壁上。（2）然后將貼有組織塊的瓶壁朝上，加入培養(yǎng)液，塞上瓶塞，傾斜置于37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-4小時(shí)后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)。24小時(shí)后補(bǔ)充培養(yǎng)液，一般3-5天更換培養(yǎng)液。（3）一般情況下，組織塊貼壁后24小時(shí)細(xì)胞就從組織塊四周長出，5-7天組織塊中央的組織細(xì)胞逐漸壞死脫落，組織塊四周的貼壁細(xì)胞也逐漸形成層片。目前二十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)2、細(xì)胞原代培養(yǎng)酶解制備單細(xì)胞：根據(jù)不同的組織對(duì)象采用適當(dāng)?shù)拿赶韩@得動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。胚胎等組織細(xì)胞潛伏期短，第二天既可見生長，一周便可接連成片；成體組織來源的細(xì)胞潛伏期長，一般要一周左右。最常用的酶解液有胰蛋白酶和膠原酶，鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶等也可用于動(dòng)物細(xì)胞的消化。EDTA適合消化傳代細(xì)胞，常與胰蛋白酶一起使用。目前二十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)熱消化冷消化目前二十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)（Passageculture/Subculturing）是指將原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的過程。細(xì)胞的體外大量增殖以及細(xì)胞系的建立是通過傳代培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)的。注意：每進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱為傳一代。這里的傳代代數(shù)與細(xì)胞代數(shù)或倍增不同，“一代”是指從細(xì)胞接種培養(yǎng)到分離再培養(yǎng)期間的一段時(shí)間。在細(xì)胞一代中，細(xì)胞約能倍增3～6次。懸浮生長的細(xì)胞可以采用加入新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散傳代，或者采用離心或沉降法加入新鮮培養(yǎng)基后再吹打分散進(jìn)行傳代。貼壁生長的細(xì)胞需要進(jìn)行細(xì)胞分離重新接種培養(yǎng)。一般采用酶消化法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。目前二十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)傳代培養(yǎng)方法1、吸出或者倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)的舊培養(yǎng)液。2、加入胰蛋白酶和EDTA混合液蓋滿瓶底，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶。3、2-5分鐘后檢查，有細(xì)胞間隙變大、細(xì)胞質(zhì)回縮現(xiàn)象時(shí)添加培養(yǎng)液終止消化。4、吸出消化液，加入Hanks液輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，洗去殘留消化液。5、加入培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打瓶壁，使細(xì)胞脫落制成懸液。6、計(jì)數(shù)，接種進(jìn)行傳代培養(yǎng)。酶消化法目前三十頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)一般經(jīng)過：1、組織獲得與消化2、接種3、原代培養(yǎng)4、傳代培養(yǎng)目前三十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)目前三十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)過程分析與監(jiān)測1、細(xì)胞形態(tài)檢查及活力分析：倒置顯微鏡下觀察；四唑鹽（MTT）法可以對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行分析（活細(xì)胞的線粒體脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲暨[jì]并沉淀在細(xì)胞中）。2、pH及污染檢查：含血清的新鮮培養(yǎng)液呈桃紅色，pH在7.2～7.4之間。CO2的積累使培養(yǎng)液pH下降。當(dāng)超出緩沖范圍時(shí)，培養(yǎng)液變黃，需3～4天更換一次培養(yǎng)液。CO2培養(yǎng)箱能自動(dòng)控制5%的CO2含量。細(xì)菌污染時(shí)培養(yǎng)液變渾濁；支原體易透過濾器，污染不易被發(fā)現(xiàn)。目前三十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)細(xì)胞系與細(xì)胞株1.細(xì)胞系(Cellline)是由原代培養(yǎng)經(jīng)傳代培養(yǎng)純化，獲得的以一種細(xì)胞為主的、能在體外長期生存的不均一的細(xì)胞群體。第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞即稱之為細(xì)胞系。不能連續(xù)培養(yǎng)的為有限細(xì)胞系(Finitecellline)，能連續(xù)培養(yǎng)下去的為連續(xù)細(xì)胞系(Infinitecellline)。2.細(xì)胞株(Cellstrain)是指從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。細(xì)胞株的建立需要從細(xì)胞系群體中分離出一個(gè)細(xì)胞，并使其在體外繁殖成為新細(xì)胞群體。目前三十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)靶細(xì)胞的分離純化靶細(xì)胞的分離純化方法分為自然純化和人工純化。1、自然純化是多次傳代過程中，利用混合系中某一種細(xì)胞的增殖優(yōu)勢不斷排擠其他類型細(xì)胞而最終被純化的方法。此方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，選擇純化的細(xì)胞具有盲目性。2、人工純化根據(jù)某一類型的細(xì)胞生長條件，抑制其他細(xì)胞生長，從而達(dá)到純化的目的。（1）細(xì)胞因子依賴法：利用靶細(xì)胞對(duì)特殊細(xì)胞因子的需求與其他細(xì)胞分離。（2）反復(fù)貼壁法：利用不同細(xì)胞貼壁速度快慢的差異進(jìn)行分離。（3）酶消化法：利用不同細(xì)胞對(duì)消化酶的耐受性差異進(jìn)行分離。（4）機(jī)械法：硅膠軟刷刮除非靶細(xì)胞。目前三十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)細(xì)胞株的純化細(xì)胞株的建立需要從細(xì)胞系群體中分離出一個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行體外繁殖成為新的細(xì)胞群體。1、毛細(xì)管法：通過無限稀釋法將細(xì)胞稀釋成1個(gè)細(xì)胞/ml，然后在顯微鏡下用毛細(xì)管將細(xì)胞分離出來單獨(dú)培養(yǎng)形成單克隆細(xì)胞群體。2、有限稀釋法：將細(xì)胞懸液梯度稀釋后接種到96孔板，進(jìn)行一定時(shí)間的培養(yǎng)，理論上某一個(gè)孔中會(huì)有單克隆細(xì)胞群體。目前三十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)適合工業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)胞株原代細(xì)胞傳代細(xì)胞二倍體細(xì)胞異倍體細(xì)胞融合細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞基因工程細(xì)胞有限系細(xì)胞無限系細(xì)胞永生細(xì)胞正常細(xì)胞目前三十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞是指細(xì)胞發(fā)生遺傳改變而產(chǎn)生永生化，即由有限性細(xì)胞系轉(zhuǎn)化為無限性細(xì)胞系，可以在體外進(jìn)行無限傳代和生長繁殖。轉(zhuǎn)化細(xì)胞方法：1.細(xì)胞自轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)的細(xì)胞自發(fā)出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。這種現(xiàn)象在許多正常二倍體長期傳代過程中出現(xiàn)?？赡艿囊蛩匕ǎ貉遒|(zhì)量、溫度或pH不穩(wěn)定、病毒污染等。2.人工誘發(fā)轉(zhuǎn)化采用誘導(dǎo)劑使正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。凡是可以改變DNA結(jié)構(gòu)的因素都可以稱為誘導(dǎo)劑，包括化學(xué)、物理和病毒誘導(dǎo)劑。目前三十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)常用細(xì)胞株CHO細(xì)胞(Chinesehamsterovarycell)：中國倉鼠卵巢細(xì)胞，亞二倍體(2n-1)，有多種突變株。貼壁生長，也可以懸浮培養(yǎng)，對(duì)剪切力和滲透壓改變有較高的忍受能力。CHO細(xì)胞能表達(dá)糖基化蛋白藥物：組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)、促紅細(xì)胞生成素（EPO）、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、粒細(xì)胞集落刺激因子（GCSF）、DNA酶I、凝血因子VIII等。目前三十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)常用細(xì)胞株Vero細(xì)胞（Verocell）:是1962年日本從非洲綠猴腎中分離的細(xì)胞。成上皮型，異倍體，貼壁型，是最常用的大規(guī)模培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞之一。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒。目前四十頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)常用細(xì)胞株293T細(xì)胞（293tcell）:

293細(xì)胞系是原代人胚腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染5型腺病毒（Ad5）DNA的永生化細(xì)胞。此細(xì)胞室溫不貼壁，37℃幾日后重新貼壁。目前四十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)：在人工條件下（pH值、氧氣、二氧化碳、營養(yǎng)、溫度等）進(jìn)行高密度大量增殖細(xì)胞的技術(shù)。培養(yǎng)流程：組織--》消化--》原代培養(yǎng)--》傳代培養(yǎng)（細(xì)胞系和細(xì)胞株）--》小規(guī)模培養(yǎng)（培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿）--》大規(guī)模培養(yǎng)（生物反應(yīng)器）--》代謝產(chǎn)物（分離、純化）目前四十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)1、轉(zhuǎn)管/瓶培養(yǎng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)是在轉(zhuǎn)管培養(yǎng)基礎(chǔ)上為擴(kuò)大培養(yǎng)量而改進(jìn)的。轉(zhuǎn)瓶或轉(zhuǎn)管固定在旋轉(zhuǎn)支架上，傾斜角度一般為5o-10o。細(xì)胞貼附在轉(zhuǎn)瓶或轉(zhuǎn)管的內(nèi)表面，培養(yǎng)液隨旋轉(zhuǎn)而流動(dòng)，細(xì)胞交替接觸營養(yǎng)和空氣，利于細(xì)胞吸收營養(yǎng)、進(jìn)行氣體交換。目前四十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)2、微載體培養(yǎng)系統(tǒng)微載體培養(yǎng)是將傳統(tǒng)的一維平面貼附擴(kuò)展為三維立體貼附，增加了貼壁細(xì)胞的貼壁面積，有利于貼壁細(xì)胞的大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)。微載體指直徑60-250μm，能適用于貼壁細(xì)胞生長的微珠。微載體一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。顯微鏡下的高密度微載體目前四十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性不含能毒害細(xì)胞的成分；微載體須與細(xì)胞有良好的相容性，一般帶正電荷；密度應(yīng)略大于培養(yǎng)基；粒徑在40～120μm范圍，生理鹽水溶脹后增大到60~250μm，粒度分布地均勻，徑差不大于20~25μm；良好的光學(xué)透明性；能在PBS中耐120~125℃、20~30min高溫滅菌；應(yīng)是非剛性材料；不吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分；收獲細(xì)胞或細(xì)胞制品容易，不影響蛋白質(zhì)分離純化；價(jià)廉，能重復(fù)使用。目前四十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)微載體的類型目前市售（國際）種類有十幾種以上：大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用的微載體主要是固體微載體，包括實(shí)心微載體和多孔微載體。實(shí)心微載體：細(xì)胞能貼附在微載體表面生長。多孔微載體：微載體內(nèi)部具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的小孔，細(xì)胞在微載體的內(nèi)部生長。目前四十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點(diǎn)微載體培養(yǎng)原理將對(duì)細(xì)胞無害的顆粒（微載體）加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長，同時(shí)通過持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。絲網(wǎng)微載體通氣