第四章基因工程的主要技術(shù)及其原理

原理

瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶瓊脂糖凝膠電泳目前一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，是由D—半乳糖和3、6—脫水—L—半乳糖結(jié)合的鏈狀多糖

目前二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點

豬基因組DNA及PCR產(chǎn)物電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測儀等。瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），6X載樣緩沖液：Ⅰ0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液;Ⅱ0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液實驗材料、器具及藥品目前三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點相關(guān)知識：①影響瓊脂糖凝膠DNA遷移速率的因素、遷移速率由DNA的分子大小、瓊脂糖濃度、DNA的構(gòu)象、所加電壓、電場方向、堿基組成與溫度、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成等許多參數(shù)確定。

表瓊脂糖濃度與DNA分離范圍

目前四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點實驗步驟⑴1g瓊脂糖加入100ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并搖勻。）⑵用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固⑶充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。目前五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點(4)用移液器吸取總DNA或質(zhì)粒樣品4μl于點樣板上，再加入上樣緩沖液loadingbuffer，混勻后，小心加入點樣孔。⑸打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動，電泳約30min-60min。⑹將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。⑺將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護(hù)觀察罩，打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶。實驗步驟目前六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點結(jié)果與分析

圖2基因組DNA1%瓊脂凝膠電泳圖目前七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點結(jié)果與分析

圖2

PCR產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖

(1、2、3、4為PCR產(chǎn)物，M為DL2000Marker)目前八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點瓊脂糖凝膠電泳裝置目前九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點實驗步驟制膠90℃以上熔化，凝膠溫度35-43℃EB目前十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點1231、孔深2、預(yù)留尺寸3、梳子寬度1+2=膠的厚度3目前十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點-+加緩沖液目前十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點拔梳子最好在電泳槽中目前十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點-+點樣目前十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點-+電泳紫外目前十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點﹢﹣﹣﹢目前十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點目前十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點目前十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點電泳結(jié)果分析DNA空間結(jié)構(gòu)電壓

EB目前十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點脈沖電場（PFGE）解決大分子DNA電泳問題目前二十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點目前二十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點Blotting目前二十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點定義：印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA或者DNA-DNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法目前二十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點(1)Southern印跡雜交法

限制性內(nèi)切酶酶切

檢測雜交信號

提取DNA

Southern法可用于檢測特異的DNA序列片段,進(jìn)行基因定位、分子量測定等。目前二十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點SouthernBlotPartI:GelelectrophoresisfollowedbytransfertoamembraneDNACleavedwitharestrictionenzymeSmearofrestrictionfragments80度烘烤1-2h目前二十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點SouthernBlotPartII:HgybridizationofDNAonmembranetospecificprobe目前二十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點目前二十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點DNAstainedwithethidiumbromideautoradiographofhybridizedmembraneSouthernBlot目前二十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點目前二十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點目前三十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點NorthernBlotprobedwithb-globinUndifferentiatedcells+differentiationfactorNote:MakenorthernjustlikeaSouthern,exceptrunoutRNAsamplesratherthanDNAMeasuresthesteady-statelevelofmRNAtranscriptfromagivengeneSmearofRNAtranscripts目前三十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點

核酸雜交技術(shù)是目前研究核酸結(jié)構(gòu)、功能常用手段之一，不僅可用來檢驗核酸的缺失、插入，還可用來考察不同生物種類在核酸分子中的共同序列和不同序列以確定它們在進(jìn)化中的關(guān)系，其主要應(yīng)用如下圖所示：目前三十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點核酸雜交及其應(yīng)用示意圖Ⅰ.變性、復(fù)性和雜交。粗細(xì)線分別代表不同DNA。A是雜化雙鏈Ⅱ.突變體的鑒別。B代表天然DNA；C是B的缺失突變體；虛線框內(nèi)是已缺失的部分；D是顯示從天然DNA鏈鼓出小泡

Ⅲ.粗線代表探針，粗線上的X表示放射性標(biāo)記目前三十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點

在核酸雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種用于研究和診斷的非常有用的技術(shù)稱探針技術(shù)(Probe)。

探針技術(shù)在遺傳性疾病診斷上已開始應(yīng)用。例如診斷地中海貧血或血紅蛋白病，可以由已確診的病人白細(xì)胞中提取DNA，這就是診斷探針。用診斷探針檢查，不但可以對有癥狀患者進(jìn)行確診，還可以發(fā)現(xiàn)一些沒有癥狀的隱性遺傳性疾病。如從胎兒的羊水可以提取到少量DNA后，再用探針技術(shù)對此進(jìn)行產(chǎn)前診斷各種遺傳性疾病已在臨床上開展。

雜交和探針技術(shù)是許多分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究中，以及臨床診斷中得到了日益廣泛的應(yīng)用。目前三十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點Westernblot實驗技術(shù)

目前三十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點MakingaprobeUsetheknownaminoacidsequenceofaproteinSynthesiseashortDNAsequenceinvitroAA:phemettrpglucysasnCodons:UUUC

AUGUGGGAAGUGUCAAUCProbe:AAAGTACACCCTTCACAGTTAG

-P32目前三十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點Ashortsequenceofaproteinisusedtodesignasetofoligonucleotidesforuseasaprobetorecoverthegenethatencodedtheprotein.Oneoftheprobesequencewillbeaperfectmatchforthegene目前三十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點WesternBlot基本原理

在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。目前三十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點WesternBlot一般流程蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色目前三十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點通過有機溶劑或水溶法制備總蛋白水溶液提取法針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。

細(xì)胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2μg/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin，pH8.0

有機溶劑提取法對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通過層析或電洗脫法制備目的蛋白蛋白樣品的制備目前四十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點蛋白樣品的定量Bradford法

考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比。(上樣量)試劑：考馬斯亮藍(lán)工作液，0.1N鹽酸，雙蒸水，蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（將10mg/ml蛋白溶液稀釋至4.0mg/ml,3.5mg/ml,3.0mg/ml,2.5mg/ml,2.0mg/ml,1.5mg/ml,1.0mg/ml,0.5mg/ml。）管號012345678ddH2O807070707070707070蛋白標(biāo)準(zhǔn)液01010101010101010樣品101010101010101010HCL101010101010101010目前四十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：SDS是一種離子性的界面活性劑,它有強離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當(dāng)SDS與蛋白質(zhì)混合時,它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS的平均結(jié)合量是1:1.4(以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之SDS後,由於SDS帶強負(fù)價,使蛋白質(zhì)原先的帶電價微不足道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價一致(chargedensity),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素目前四十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過硫酸銨(時間)Tris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份目前四十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（％）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212目前四十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點目前四十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點轉(zhuǎn)膜膜的選擇尼龍膜硝酸纖維素膜封閉非特異性抗體結(jié)合麻煩簡單快速封閉非特異性抗體結(jié)合價格昂貴價格便宜特殊要求下的選擇需要更高的蛋白結(jié)合率（尼龍膜：480μg/cm2

；硝酸纖維素膜：80μg/cm2

）目的蛋白與硝酸纖維膜的結(jié)合能力弱需要更大的機械強度目前四十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點轉(zhuǎn)膜半干法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間，電轉(zhuǎn)10－30min。濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min或過夜。

目前四十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點目前四十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點轉(zhuǎn)膜后檢測麗春紅S染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探針的Western印跡過程。目前四十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點封閉脫脂奶粉（5％）BSAWesternBlot膜封閉液（生物試劑公司提供）目前五十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點一抗、二抗孵育把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育。37℃一小時，4℃過夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，37℃一小時，4℃過夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。目前五十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)目前五十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點WesternBlot常見問題分析目前五十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入APS和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對齊目前五十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點條帶比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適目前五十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點轉(zhuǎn)膜及抗體檢測凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個或多個白點？轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的草紙確保膜和膠塊之間沒有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫目前五十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點背景太高膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過高

原原因?qū)Σ咿D(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度目前五十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點Westernblotissimilarinconcepttonorthern,exceptusepolyacrylamideandrunoutproteinsSouthern,Northern,andWesternanalyses目前五十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點免疫化學(xué)檢測法目前五十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點Usingantibodiestodetectaclone目前六十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點重組體的轉(zhuǎn)化利用物理方法導(dǎo)入、轉(zhuǎn)化

1.質(zhì)粒的Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化(E.coli)2.質(zhì)粒的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

3.質(zhì)粒的高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化

4.顯微注射法轉(zhuǎn)化目前六十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點利用生物方法導(dǎo)入、轉(zhuǎn)染1.細(xì)胞噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染2.動物病毒DNA的轉(zhuǎn)染3.植物病毒DNA的轉(zhuǎn)染目前六十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備在不含抗生素的LB平板上涂布大腸桿菌DH5α，于37℃培養(yǎng)過夜(16-20h)；挑一個單菌落接種于25mL無菌的LB培養(yǎng)液中，37℃中速震蕩培養(yǎng)3h；將上述菌液在冰浴5分鐘,然后在4℃,4000rpm離心10分鐘;將細(xì)菌沉淀用5mL預(yù)冷的CaCl2（0.1M）重懸，冰浴一會后于4℃4000rpm離心10分鐘；將細(xì)菌沉淀用1mL預(yù)冷的CaCl2（0.1M）重懸，取200uL用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化,其余菌液加入20%的無菌甘油,搖勻后于-20℃保存?zhèn)溆?目前六十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

（1）取2μL連接產(chǎn)物，加入80μL感受態(tài)細(xì)胞，混勻，冰上放置30min。（2）將反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)移42℃水浴中，熱擊90s。（3）將反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)移至冰上2min（4）加入500-800μLLB液體培養(yǎng)基。（5）37℃，150rpm復(fù)蘇1.5h。（6）取100μL菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上（含100μg/mL的Amp）（7）37℃下培養(yǎng)16-24h。目前六十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點TransformingE.coliwithrecombinantDNA目前六十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點GrowthofBacteria目前六十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點目前六十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR技術(shù)及其應(yīng)用

目前六十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點目錄PCR的概念PCR技術(shù)的創(chuàng)建PCR的原理PCR的反應(yīng)體系和方法PCR的類型和應(yīng)用目前六十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)Polymerase:

DNA聚合酶

目前七十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴增目前七十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR技術(shù)的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)

1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。目前七十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR技術(shù)簡史

PCR的最早設(shè)想：本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。PCR技術(shù)目前七十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長PCR技術(shù)目前七十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技術(shù)目前七十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技術(shù)目前七十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR技術(shù)簡史PCR的改進(jìn)與完善：

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的一個片段，其缺點是：①此酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。PCR技術(shù)目前七十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點②其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，此種酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴增具備許多突出的優(yōu)點，但由于酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時，會導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時間內(nèi)沒能引生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。PCR技術(shù)PCR技術(shù)簡史目前七十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點94℃55℃37℃目前七十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR技術(shù)簡史1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。PCR技術(shù)目前八十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點TaqDNA聚合酶的特點：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。PCR技術(shù)PCR技術(shù)簡史目前八十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)目前八十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點72℃94℃55℃PCR循環(huán)目前八十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR技術(shù)的原理1PCR技術(shù)的基本原理

無細(xì)胞分子克隆法：在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴增了特異區(qū)段的DNA帶。

目前八十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性加熱或強酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為DNA的變性。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結(jié)合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù),這稱DNA復(fù)性,也叫退火。

目前八十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR反應(yīng)條件PCR過程目前八十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR反應(yīng)條件PCR過程目前八十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR技術(shù)目前八十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR技術(shù)復(fù)習(xí)目前八十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR技術(shù)目前九十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR技術(shù)目前九十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始PCR技術(shù)目前九十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR技術(shù)目前九十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束PCR技術(shù)目前九十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增PCR技術(shù)目前九十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點2PCR技術(shù)的特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達(dá)230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍目前九十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點2）特異性引物引物

引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。目前九十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點引物設(shè)計：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機分布,G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制。目前九十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點3）操作簡便易行PCR擴增法,只需要數(shù)小時,就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。通常的DNA擴增法是分子克隆法,首先要構(gòu)建含有目的的基因的載體,然后將它導(dǎo)入細(xì)胞后進(jìn)行擴增,還要用同位索探針進(jìn)行篩選;這種方法,要經(jīng)過DNA內(nèi)切、連接、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等相關(guān)的過程,操作復(fù)雜,一般需要數(shù)周時間。目前九十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴增擴增提取DNA分子目前一百頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點4）用途廣泛生命學(xué)科醫(yī)學(xué)工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學(xué)考古學(xué)目前一百零一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR的反應(yīng)體系和方法PCR管加熱使模板變性,退火使引物與模板DNA互補,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)制的起點,合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。

目前一百零二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點1反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uBuffer（Mg2+）

1.5mmol/LPCR技術(shù)目前一百零三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNAdNTP引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2基本過程目前一百零四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點PCR技術(shù)的基本過程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循環(huán)儀94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循環(huán)25～35次目前一百零五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)目前一百零六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點1）PCR反應(yīng)成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。3PCR反應(yīng)條件目前一百零七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L

濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l

酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。目前一百零八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點（4）dNTPdNTP濃度取決于擴增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量

dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。目前一百零九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。目前一百一十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點2）循環(huán)參數(shù)變性

使雙鏈DNA解鏈為單鏈

94oC20-30秒(2)退火

溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。目前一百一十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點（3）延伸

70-75℃,一般為72℃

延伸時間由擴增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴增效率降低錯誤摻入率增加目前一百一十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever目前一百一十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點1）不對稱PCR

目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針

基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究PCR的類型目前一百一十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點

高濃度引物低濃度引物目前一百一十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點2)反向PCR(reversePCR)

是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴增?？蓪ξ粗蛄袛U增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列目前一百一十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶目前一百一十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點3）多重PCR（復(fù)合PCR）用于檢測特定基因序列的存在或缺失。目前一百一十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點電泳引物12341234目前一百一十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點DMD：人類肌營養(yǎng)不良基因A：無外顯子8,12,17,19對應(yīng)條帶,說明病人外顯子8～19缺失B：病人A中未擴增外顯子帶的強度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者C：正常人DMD基因外顯子的一般擴增形式多重PCR檢測DMD基因缺失目前一百二十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點目前一百二十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點4）LP-PCR（Labelledprimers)

利用同位素、熒光素等對ＰＣＲ引物進(jìn)行標(biāo)記,用以直觀地檢測目的基因。特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時檢測多種基因成分病毒1病毒2病毒3病毒4目前一百二十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物目前一百二十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點5）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴增探針親和固相介質(zhì)檢測探針信號可用于基因芯片的制作目前一百二十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點6）ＲＴ－ＰＣＲ逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增目前一百二十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于十七點基因