選擇性殺滅血液制品中病原微生物病毒的研究方法介紹

選擇性殺滅血液制品中病原微生物病毒的研究方法介紹第1頁/共24頁血液制品的種類人血白蛋白人胎盤血白蛋白靜脈注射用人免疫球蛋白肌注人免疫球蛋白組織胺人免疫球蛋白特異性免疫球蛋白第2頁/共24頁主要方法1熱處理方法2有機(jī)溶劑／去污劑法(S/D)3紫外線照射法4光化學(xué)病毒滅活法5其他方法第3頁/共24頁1熱處理方法

原理：使病毒外膜蛋白和衣殼蛋白變性，使病毒包膜上的糖蛋白棘突發(fā)生改變。從而阻止病毒吸附于宿主細(xì)胞。此外，熱力也可破壞病毒復(fù)制時所需的酶類。方法：干熱處理、蒸汽加熱處理、懸浮加熱處理、巴斯德加熱處理第4頁/共24頁各種熱處理方法的比較滅活方法處理方法滅活病毒無效病毒主要應(yīng)用干熱處理80℃干熱處理72hHIV、HCV和HBV等耐熱的無脂質(zhì)包膜的人微小病毒B19F1I的病毒滅活蒸汽加熱60℃的熱蒸汽加熱10hHIV以及肝炎病毒等暫未發(fā)現(xiàn)靜注免疫球蛋白制品的病毒滅活懸浮加熱處理懸浮于氯仿或庚烷中，60℃加熱處理20小時各種病毒有發(fā)現(xiàn)肝炎病毒中純度FⅧ濃制劑和FⅨ復(fù)合物巴斯德加熱處理法有保護(hù)凝血因子穩(wěn)定劑存在，60℃處理10小時各種脂包膜病毒、蛋白包膜病毒極少數(shù)情況下對乙型肝炎和人微小病毒B19無效各種液態(tài)的血液制品第5頁/共24頁巴斯德加熱處理法1948年，巴斯德消毒法首先由Gellts等在白蛋白的生產(chǎn)過程中應(yīng)用，即將溶液狀態(tài)的白蛋白經(jīng)60℃10小時加熱，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人免疫缺陷病毒(HIV)均可被滅活，臨床應(yīng)用及動物實驗沒有傳播病毒性疾病的報道。經(jīng)巴斯德加熱處理的人血白蛋白制劑在防止肝炎傳播方面早有良好的記錄第6頁/共24頁這幾種方法中，用巴斯德消毒法(60℃，10h)處理液體狀態(tài)的血制品效果較好。滅活的同時會導(dǎo)致細(xì)胞成分發(fā)生變性和代謝破壞，不適合對全血和細(xì)胞成分的消毒第7頁/共24頁2有機(jī)溶劑／去污劑(S／D)法

S／D法是由美國紐約血液中心于八十年代中期開發(fā)的病毒滅活方法，自1985年該技術(shù)獲得FDA認(rèn)可在美國獲準(zhǔn)使用以來，迄今已在世界上多個國家和多種血液制品中得到推廣，具有良好的應(yīng)用前景。 其機(jī)制就是利用化學(xué)試劑破壞脂包膜病毒外膜結(jié)構(gòu)的完整性或靶細(xì)胞受體識別位點，使其失去傳染性或復(fù)制能力。第8頁/共24頁用1%3-正丁基磷酸鹽(Tri-n-butylphsophate,TNBP)TNBP加1%TritonX-100

在30℃處理血漿4h。處理后的血漿按每200ml分裝,于-30℃保存2年,血漿蛋白的活性仍保持良好,凝血因子也未見被激活。第9頁/共24頁S／D法的優(yōu)點：對脂包膜病毒特別有效，且具有不會使蛋白變性，較高的制品回收率，所應(yīng)用設(shè)備簡單等。S／D法的缺點：據(jù)報道,經(jīng)其處理的血制品仍可引起使用者發(fā)生細(xì)小病毒B18和HAV感染。將S/D法與巴氏消毒法(60℃,10h)聯(lián)用,因巴氏消毒法可滅活蛋白包膜病毒而克服以上缺點。第10頁/共24頁3

紫外線照射法紫外線(UV)因其良好的殺菌作用,能刺激血液中免疫成分的活性,對蛋白質(zhì)損害輕微,早在四十年代即曾用于血液制品凈化。UV一方面可使核酸突變,阻礙其復(fù)制、轉(zhuǎn)錄封鎖及蛋白質(zhì)的合成;另一方面,產(chǎn)生的自由基可引起氨基酸光電離,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。第11頁/共24頁UV滅活的優(yōu)點：UV消毒血液制品時,滅活病毒效果好,特別是對抗力較強(qiáng)的無脂質(zhì)包膜和耐熱病毒,而對血液成分活性的破壞亦并不嚴(yán)重。UV消毒的缺點：經(jīng)紫外線照射的病毒具有在可見光照射下重新復(fù)性的可能，若紫外線與一些化學(xué)光敏劑聯(lián)合使用，則可提高其破壞病毒核酸的作用。第12頁/共24頁4光化學(xué)病毒滅活法

利用光敏劑殺滅病毒，主要是依靠光敏劑在光照下產(chǎn)生的單線態(tài)氧或自由基氧化損傷病毒的分子結(jié)構(gòu)，從而殺滅病毒。根據(jù)光敏劑滅活病毒的機(jī)理和靶點不同可分為三類：以膜為靶點的光敏劑、以核酸為靶點的光敏劑、多靶點的光敏劑

第13頁/共24頁各種光敏劑的比較光敏劑有效成分（結(jié)構(gòu)）靶向位點最大吸收峰滅活對象及范圍無效病毒及對象血卟啉衍生物雙卟啉醚以膜為靶點630nmHSV-1，CMV等有包膜病毒，

而對無包膜病毒無效酞菁類化合物與卟啉類似以膜為靶點650~670nm紅細(xì)胞制品的病毒滅活暫無報道補(bǔ)骨脂內(nèi)酯衍生物平面芳香族化合物以核酸為靶點365nm滅活血小板制品中的病毒不適合用于紅細(xì)胞制品的病毒滅活吩噻嗪類化合物平面雜環(huán)化合物多靶點300001ux不僅能滅活有包膜病毒。而且能滅活無包膜病毒，對細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的病毒都有效暫無報道~45000lux部花菁540帶負(fù)電荷的雜環(huán)化合物以膜為靶點540nm各種包膜病毒對無包膜病毒無效第14頁/共24頁4.1亞甲藍(lán)／光化學(xué)法病毒滅活使用無菌技術(shù)連接血漿袋和亞甲監(jiān)光照袋，將溶入亞甲藍(lán)的血漿收集到光照袋后放入4±2℃醫(yī)用病毒滅活箱，100份血漿加入亞甲藍(lán)后含量為0.93～3.13μmol／L(1.28±0.30μmol／L)，其中4份容量為260～280ml血漿加入亞甲藍(lán)后濃度<1μmol／L，經(jīng)熒光(30000lux)照射35min，用過濾器過濾血漿，經(jīng)濾過后亞甲藍(lán)殘留量為0.07～0.62μmol／L(0.23±0.12mol／L)，絕對殘留量為0.014～0.146μmol(0.005±0.026μmo1)。第15頁/共24頁病毒滅活效果的測定采用口炎皰疹病毒(VSV)和Sindbis病毒作為指示病毒，以細(xì)胞病變法檢測滅活前后病毒滴度檢測，vero細(xì)胞作為指示細(xì)胞，病毒滴度按Karber法計算。Sindhis病毒和VSV病毒滅活前病毒滴度(1gTCID50)均為6.0，滅活后均為0.5，病毒降低量>4，病毒滅活效果符合國家規(guī)定要求第16頁/共24頁血漿主要成分分析在制備前隨機(jī)抽取100份血漿，血漿量為200～280ml，設(shè)亞甲藍(lán)滅活病毒前組及亞甲藍(lán)滅活病毒后組，分別對血漿主要成分進(jìn)行下列成份測定：纖維蛋白原、總蛋白、白蛋白、血漿Ⅷ因子。第17頁/共24頁不同的滅活條件，其滅活效果不同。黃慶等以MB為光敏劑，以登革熱病毒為指示病毒，以單波長點陣式發(fā)光二極管為光源，將指示病毒與不同濃度的MB工作液混合后，收集不同光照強(qiáng)度的MB／病毒混合液，研究對RNA脂包膜病毒的滅活效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)MB濃度<1.0mg／ml時，病毒滅活效果并不理想，而當(dāng)MB濃度≥1.0mg／ml時，可在較短時間內(nèi)完全滅活指示病毒。周錫鵬等將含有1μmol／L的MB血漿置于40000lux的可見光下，室溫條件處理血漿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除凝血因子Ⅶ，PT和APTT有一定程度降低外，其它血漿蛋白活性未見明顯變化，血漿中的葡萄糖、多種無機(jī)鹽含量及血漿pH值未受影響第18頁/共24頁4.2補(bǔ)骨脂素病毒滅活法在UVA照射下，補(bǔ)骨脂素分子兩端與病毒核酸嘧啶間形成環(huán)丁烷類型的共價鍵。如果這種共價鍵形成在雙股核酸相鄰的嘧啶堿基上，兩股核酸間則形成交聯(lián)。單股核酸如果折疊成雙股區(qū)也能形成這種交聯(lián)。當(dāng)交聯(lián)度達(dá)到1／100堿基時。病毒核酸就不能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，病毒也不能復(fù)制。第19頁/共24頁補(bǔ)骨脂素除了能滅活多種病毒外，它還能滅活白細(xì)胞。這不僅無害，甚至還可能有利于消除白細(xì)胞相關(guān)病毒以及白細(xì)胞輸送后所導(dǎo)致的異體免疫作用和移植物抗宿主疾病。第20頁/共24頁5其他方法5.1靶向核酸化學(xué)滅活作用對象廣,對包膜病毒和非包膜病毒均有效,對其他病原