系統(tǒng)生物學轉錄組學與microRNA研究

DNARNA蛋白質(zhì)基因組學RNA組學蛋白質(zhì)組學目前一頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點蛋白質(zhì)編碼基因數(shù)量人：30,000果蠅和線蟲：12,000-14,000釀酒酵母：6,200假單孢菌：5,500人和鼠的蛋白質(zhì)編碼基因99%是共同的。人個體間單倍體基因組的堿基差異300萬個，其中1萬個（0.3%）出現(xiàn)在蛋白質(zhì)編碼基因中。98%轉錄產(chǎn)物是非編碼蛋白RNA。2倍2倍目前二頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點RNA的分類細胞核和胞液線粒體功能核蛋白體RNArRNAmtrRNA核蛋白體組成成分信使RNAmRNAmtmRNA蛋白質(zhì)合成模板轉運RNAtRNAmttRNA轉運氨基酸不均一核RNAhnRNA成熟mRNA的前體小核RNAsnRNA參與hnRNA的剪接、轉運小胞漿RNAscRNA/7SL-RNA蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號識別體的組成成分目前三頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點新定義Thecompletecollectionoftranscribedelementsofthegenome.(Affymetrix,2004)mRNArRNA,tRNAsnmRNAs(smallnon-messengerRNAs)microRNAsandsiRNAs(smallinterferringRNAs)snoRNAs(smallnucleolarRNAs)核仁小分子RNAsnRNAs(smallnuclearRNAs)Othernon-codingRNAsLongnon-codingRNA(lncRNA)目前四頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點有些小RNA分子能直接調(diào)控某些基因的開關從而控制細胞的生長發(fā)育并決定細胞分化的組織類型小RNA分子本身又包含了若干類RNA，根據(jù)小RNA的生成、結構和功能大約可分為以下三類：miRNA（microRNA)siRNA(smallinterferingRNA)其他小RNA目前五頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點

MicroRNA簡介★

(1)長度為21nt左右核苷酸的內(nèi)源性單鏈小分子RNA；(2)存在65nt左右的發(fā)夾結構前體；(3)基因座位于蛋白質(zhì)基因間隔區(qū)；(4)其DNA序列在近源物種間高度保守?！?/p>

miRNA具有十分重要的調(diào)控功能，它們主要參與基因轉錄后水平的調(diào)控。能夠通過與靶mRNA特異性的堿基配對引起靶mRNA的降解（植物中較為常見）或者抑制其翻譯（動物中較為常見），從而影響了靶mRNA的表達。目前六頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點microRNA(miRNA)是廣泛存在于真核生物中的一組短小的、不編碼蛋白質(zhì)的RNA家族，它們是由19-23個核苷酸組成的單鏈RNA（3‘端可有1~2個堿基長度的變化）表達具有組織特異性和階段特異性。即：在不同組織中表達有不同類型的miRNA；在生物發(fā)育的不同階段里有不同的miRNA表達與靶mRNA3’-UTR結合，序列特異性的在轉錄后水平調(diào)控基因的翻譯表達，在生物發(fā)育、脂肪代謝、細胞的分化、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用目前七頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRNA具有高度保守性，即各種miRNA都能在其他種系中找到同源體；miRNA獨有的特征：其5’端第一個堿基對U有強烈的傾向性，而對G卻有抗性，但第二到第四個堿基缺乏U，一般來講，除第四個堿基外，其他位置堿基通常都缺乏CmiRNA執(zhí)行一定的生物學功能：對與其互補的mRNA表達水平具有調(diào)節(jié)作用；一些偏大的miRNA(27nt)可能參與了基因組的重組裝參與生物的發(fā)育與多種生理、病理過程目前八頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點199320002001200220032004200520062007microRNA的研究歷史Dr.VictorAmbros目前九頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點2002年入選《science》年度十大科學發(fā)現(xiàn)之首目前十頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRNAandCancerThefirstdemonstrationofalinkbetweenmiRNAgenesandcancer.目前十一頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點ThefirstpapertoshowthatthederegulationofasinglemiRNAgenecanleadtocancer.AnelegantstudythatshowsapathogeneticlinkbetweenmiRNAsandtargetoncogenes.目前十二頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點目前十三頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRNAcontrolssomeplantphenotype目前十四頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點據(jù)體內(nèi)外實驗研究表明miRNA的生成需要兩個步驟：1)由長的內(nèi)源性轉錄本（pri-miRNA)經(jīng)Drosha酶作用生成70nt左右的miRNA前體(pre-miRNA)，該過程發(fā)生在細胞核2)將pre-miRNA經(jīng)Dicer酶作用加工為成熟miRNA，該過程發(fā)生在細胞質(zhì)中。microRNA的加工成熟目前十五頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點通過生物信息的手段分析了microRNA在蛋白相互作用網(wǎng)絡和轉錄因子-microRNA相互調(diào)控網(wǎng)絡中的作用目前十六頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點據(jù)體內(nèi)外實驗研究表明miRNA的生成需要兩個步驟：1)由長的內(nèi)源性轉錄本（pri-miRNA)經(jīng)Drosha酶作用生成70nt左右的miRNA前體(pre-miRNA)，該過程發(fā)生在細胞核2)將pre-miRNA經(jīng)Dicer酶作用加工為成熟miRNA，該過程發(fā)生在細胞質(zhì)中。microRNA的加工成熟目前十七頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點首先由基因組轉錄形成長鏈RNA分子——pri-miRNA目前十八頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點約60%的microRNA為獨立轉錄表達；約15%miRNA為成簇存在而共同轉錄；其余還有約25%的miRNA定位于功能基因內(nèi)含子，隨基因轉錄表達。目前十九頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點Pri-miRNA經(jīng)雙鏈RNA核酸酶Drosha酶作用，加工形成70-100nt長度的pre-miRNA目前二十頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點Pre-miRNA在Exportin5介導作用下轉運出胞核至胞質(zhì)中進行下一步加工目前二十一頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點Pre-miRNA在胞質(zhì)中經(jīng)雙鏈RNA核酸酶Dicer酶作用加工形成單鏈成熟miRNA分子目前二十二頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRNA發(fā)揮作用過程19-23nt的成熟miRNA形成后與其他蛋白共同組成RNA介導的沉默復合體（RISC）參與RNA干擾途徑目前二十三頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRNA形成RISC復合體后可與特定的靶mRNA結合，這種結合不要求嚴格的互補配對。結合后導致靶mRNA翻譯的抑制翻譯抑制目前二十四頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點5’endofthesmallRNA,2–8,knownasthe“seedregion”donothaveacomplex

secondarystructureandarelocatedinaccessibleregionsofthe

RNAmicroRNA識別靶位點目前二十五頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點microRNA作用機制目前二十六頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點目前二十七頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點21-ntdsRNAstargetingselectedpromoterregionsofhumangenescausedlong-lasting

andsequence-specificinductionoftargetedgenes目前二十八頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRNA與siRNA的聯(lián)系：均為Dicer的產(chǎn)物長度均為22nt左右，5’端是磷酸基，3’端是羥基均需Argonaute家族蛋白的存在同為RISC的組分二者進化關系上可能的兩種推論：siRNA是miRNA的補充miRNA在進化過程中替代了siRNA沉默機制有重疊目前二十九頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRNA的加工成熟過程與RNAi技術中常用的siRNA有許多相似之處——均經(jīng)過Dicer酶對雙鏈RNA的識別加工而形成單鏈RNA分子。目前三十頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRNAsiRNA產(chǎn)生細胞內(nèi)RNA的固有組分之一（正常）RNAi的活性形式，病毒感染和人工插入dsRNA之后誘導而產(chǎn)生（異常）來源內(nèi)源轉錄本轉基因或病毒RNA（外源）直接來源發(fā)夾狀pre-miRNA長dsRNA結構單鏈雙鏈，3‘端有2個非配對堿基，通常為UU互補性不完全互補，存在錯配現(xiàn)象完全互補對靶RNA特異性相對較低，一個突變不影響miRNA的效應較高，一個突變即引起RNAi沉默效應的改變途徑miRNA途徑RNAi途徑對RNA的影響在RNA代謝的各個層面進行調(diào)控降解靶mRNA功能調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達，在蛋白質(zhì)合成水平發(fā)揮作用，與mRNA的穩(wěn)定性無關抑制轉座子活性和病毒感染，在轉錄后水平發(fā)揮作用,影響mRNA的穩(wěn)定性miRNA與siRNA的區(qū)別目前三十一頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點microRNA研究的興起與發(fā)展miRNA發(fā)展中遇到的問題：在各種生物中尋找miRNA發(fā)現(xiàn)miRNA的靶基因揭示miRNA的功能miRNA？目前靶基因檢測工作成為miRNA功能研究的瓶頸目前三十二頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRNA的獲取miRNA分子的序列短小1）在基因組中存在較多的互補序列2）在不同生物體內(nèi)與靶基因結合的方式也不盡相同3）通常與多種蛋白相互作用

這使得建立一個有效而且普遍適用的研究方法異常困難。#到目前為止,miRBase上公布的miRNA總數(shù)將近3000種。#現(xiàn)在已知靶基因的miRNA多是通過基因克隆和生物信息學篩選的方法發(fā)現(xiàn)的。目前三十三頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRNA的獲取——系統(tǒng)生物學篩選隨著生物全基因組測序的完成,利用計算機對基因組序列進行搜索可以大大提高miRNA的鑒定效率。所以,人們根據(jù)目前已知的miRNA基因序列總結它們的特征和規(guī)律,編寫了一些計算機程序,通過對生物基因組數(shù)據(jù)庫進行搜索,可以找到那些可能為miRNA的基因序列,然后通過Northernblotting來篩選真正的miRNA基因。

生物信息學方法是依據(jù)在不同的物種中，其成熟的miRNA具有較大的序列同源性以及前體的莖環(huán)結構具有相當大的保守性這一特征在基因組數(shù)據(jù)庫中搜索新的miRNA基因。該方法根據(jù)比較基因組學原理并結合生物信息軟件在已測序基因組中進行搜索比對，根據(jù)同源性的高低再進行RNA二級結構預測，將符合條件的候選miRNA與已經(jīng)通過實驗鑒定的miRNA分子進行比較分析，最終確定該物種miRNA的分布及數(shù)量。近年來隨著miRNA預測方法的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)的miRNA數(shù)量呈幾何級數(shù)增長。這些預測方法從簡單的序列比對搜索發(fā)展到現(xiàn)在的機器學習算法，程序設計越來越智能化，復雜化。目前三十四頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRNA的獲取——系統(tǒng)生物學篩選系統(tǒng)生物學手段可以說是一種更高通量的方法。通常有以下幾種方法:①miRscan是一種基于二級結構的預測程序,通過掃描兩種系之間是否存在同源的莖環(huán)結構,應用于檢測脊椎動物和線蟲的候選基因。目前三十五頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRNA的獲取——生物信息學篩選②Mirseeker是一種檢查RNA序列莖環(huán)結構的預測程序,應用于篩選昆蟲的候選基因。它是根據(jù)3個標準來預測的:一是具有長度為70～100nt莖環(huán)結構的Pre-miRNA;二是不同種系生物中Pre-miRNA的保守性;三是miRNA的核苷酸差異性。③ERPIN是一種類似于BLAST的校對程序,用于搜尋動物基因組中與miRNA序列類似的序列。④MiPred可以通過randomforest預測模型和miRNA特征的結合,區(qū)分miRNA的真正前體和假冒前體。目前三十六頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點目前三十七頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRBase序列數(shù)據(jù)庫

miRBase序列數(shù)據(jù)庫是一個提供包括miRNA序列數(shù)據(jù)、注釋、預測基因靶標等信息的全方位數(shù)據(jù)庫，是存儲miRNA信息最主要的公共數(shù)據(jù)庫之一。miRBase提供便捷的網(wǎng)上查詢服務，允許用戶使用關鍵詞或序列在線搜索已知的miRNA和靶標信息，詳情請（）。2012年8月1日正式發(fā)布。相比于以往版本的數(shù)據(jù)庫（SangermicroRNA序列數(shù)據(jù)庫），19.0版數(shù)據(jù)庫進行了巨大的數(shù)據(jù)更新：miRNA發(fā)夾前體序列已升至21264條，新增3171條；成熟miRNA升至25141條，新增3625條；已發(fā)布的miRNA序列共涵蓋193個物種，相比于18.0版新增25個物種。新版數(shù)據(jù)庫對miRNA序列注釋和命名進行了系統(tǒng)的修正，miR*命名已經(jīng)終止使用，取而代之的是-5p和-3p的命名法。目前三十八頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRNA的確認判斷標準:

①能夠通過與特定大小的總RNA樣品雜交得到22個堿基對(～22nt)的產(chǎn)物(即需要Northern雜交或引物延伸反應驗證表達)。②所得的序列是從特定大小的(～22nt)的小分子RNA庫中克隆到的,并且必需與克隆的來源物種的基因組序列完全匹配。③經(jīng)過前體的二級結構預測,有發(fā)夾狀的二級結構,并且成熟的miRNA序列在發(fā)夾的一條臂上。④成熟的miRNA序列與預測的二級結構在不同物種間有保守性。⑤在Dicer突變的系統(tǒng)中,前體的積累增多。要確認基因克隆獲得的或生物信息學分析預測的基因是否為真正的miRNA,就應該采用上面5個原則來檢驗。目前三十九頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRNA的靶基因miRNA的靶基因預測miRNA的靶基因檢測miRNA的生物學功能目前四十頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點

miRNA的靶基因預測

以前,研究miRNA的靶基因依賴于正向遺傳學方法,包括突變體的產(chǎn)物、變形篩選、定位克隆和miRNA及其靶基因的確認,如lin24和let27及它們的靶基因的發(fā)現(xiàn)。在果蠅中,miRNAbantam及其靶基因hid的發(fā)現(xiàn)就是正向遺傳學研究miRNA的經(jīng)典過程。

反向遺傳學聯(lián)合生物信息學的方法比正向遺傳學更優(yōu)越。它主要是由軟件來預測miRNA的靶基因并為分子實驗提供指標，其基本原理是基于miRNA與其靶基因的自然配對。已知miRNA及其靶基因之間的對比和相關性,lin24、let27和bantam基因的確認等都為計算機程序發(fā)展提供了更多的信息。計算機程序預測方法在植物種屬中運用的很成功,而在動物中則不是很成功,這可能是因為植物中的miRNA與其靶基因幾乎完全配對結合。而在動物中,miRNA與靶基因mRNA通常以不精確的堿基互補配對結合。目前四十一頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點

miRNA的靶基因預測

——miRNA的研究意義之重大是毋庸置疑的。然而，與新的miRNA的頻頻發(fā)現(xiàn)相比，miRNA的功能研究相對緩慢?！侥壳盀橹梗诎l(fā)現(xiàn)的4449多個miRNA中，確定功能的miRNA僅有幾十個?！獙е耺iRNA功能研究進展緩慢的非常重要的原因是miRNA的作用靶標難以確定。——通過實驗方法確定miRNA的作用靶標非常耗時，目前尚無高通量的靶標鑒定方法。

因此，通過理論方法預測miRNA的作用靶標成為當前識別miRNA作用靶標的較為理想的途徑。以下重點介紹幾種經(jīng)典預測軟件的算法分析：目前四十二頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRNA幾種常見的預測方法下面概括介紹幾種常見的預測方法：(ⅰ)miRanda.miRanda是最早的一個利用生物信息學對miRNA靶基因進行預測的軟件,由Enright等人于2003年設計開發(fā).其對3′UTR的篩選依據(jù)主要是從序列匹配、miRNA與mRNA雙鏈的熱穩(wěn)定性以及靶位點的保守性三個方面進行分析.miRanda軟件首先選取了黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中已知的73條miRNA作為探針,采用類似于Smith-Waterman的算法對9805個3′UTR進行堿基互補分析.——首先,互補參數(shù)被設定為:G︰C,A︰U為+5,G︰U為+2,其他配對方式為?3,同時起始空位(gap-opening)罰分為?8,延伸空位(gap-extension)罰分為?2;*序列比對就是通過一定的算法對兩個或多個序列進行比較,找出序列間最大的相似性匹配。*Smith&Waterman算法是一種經(jīng)典的序列比對算法,在雙序列比較的情況下具有比較好的速度和結果,但是在進行序列數(shù)據(jù)庫搜索時則顯得處理速度不足。目前四十三頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRanda——其次,為體現(xiàn)與靶基因作用過程中miRNA5′端和3′端的不對稱性,5′端的前11個堿基的互補分值(complementarityscores)將乘以一個scale參數(shù);——最后,miRNA與靶mRNA的互補還要遵循以下4個規(guī)則:miRNA第2~4位堿基和靶基因精確匹配;第3~12位堿基和靶基因錯配不得多于5個;9~L-5(L為miRNA總長)位堿基最少一個錯配;最后5個堿基錯配不得多于2個.目前四十四頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點miRanda在熱穩(wěn)定性方面,miRanda采用Vienna軟件包計算miRNA與3′UTR作用的自由能(ΔG).在物種間保守性方面,要求靶位點在多物種3′UTR比對中相同位置處堿基相同.綜合以上3條原則,miRanda選取每條miRNA相對的3′UTR中排名前10位的基因,作為miRNA的候選靶基因,對于多個miRNA對應于同一靶位點的情況,miRanda則使用貪心算法(GreedyAlgorithm)選取其中得分最高且自由能最低的那一對.目前四十五頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點目前四十六頁\總數(shù)五十頁\編于二十一點TargetScan(ⅱ)TargetScan和TargetScanS.TargetScan是Lewis等人在2003年開發(fā)的一款用于預測哺乳動物miRNA靶基因的軟件,該軟件將RNA間相互作用的熱力學模型與序列比對分析相結合,預測不同物種間保守的miRNA結合位點.與miRanda不同,在TargetScan的算法中,要求miRNA5′端第2~8位堿基與mRNA的3′UTR完全互補,這7個核苷酸被稱作“miRN