實(shí)驗(yàn)十三流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)腫瘤治療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋

實(shí)驗(yàn)十三流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)腫瘤治療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡指導(dǎo)教師：唐穎1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)胞凋亡、及流式細(xì)胞技術(shù)原理等基本知識(shí)。學(xué)習(xí)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的方法。學(xué)習(xí)流式細(xì)胞技術(shù)標(biāo)本的制作方法，了解流式細(xì)胞儀的使用。2.實(shí)驗(yàn)原理2.1細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)知識(shí)2.2流式細(xì)胞技術(shù)的一般原理及應(yīng)用2.3用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理2.1細(xì)胞凋亡的基本知識(shí)：定義：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定程序控制下的自主死亡過(guò)程。細(xì)胞凋亡同細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化一樣是機(jī)體生存和發(fā)育離不開(kāi)的最基本的生物現(xiàn)象，通過(guò)凋亡可以平衡機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的數(shù)目，清除衰老、過(guò)剩、有害的細(xì)胞。細(xì)胞凋亡異常會(huì)引起免疫性疾病或腫瘤等。

（一）、細(xì)胞壞死是細(xì)胞受到急性強(qiáng)力傷害時(shí)立即出現(xiàn)的反應(yīng)。早期表現(xiàn)為細(xì)胞膜破壞，線粒體腫脹。繼而溶酶體破裂,細(xì)胞內(nèi)容物流出,引起炎癥。細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別（二）細(xì)胞凋亡cellapoptosis

Kerr（1972）最先提出，與細(xì)胞壞死的區(qū)別是：①細(xì)胞通過(guò)出芽的方式形成許多凋亡小體；②凋亡小體內(nèi)有結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器；③不引起炎癥；④線粒體無(wú)變化，溶酶體活性不增加；⑤內(nèi)切酶活化，DNA有控降解，凝膠電泳圖譜呈梯狀；⑥凋亡通常是生理性變化，而細(xì)胞壞死是病理性變化。細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別胸腺細(xì)胞正常凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)流式細(xì)胞法檢測(cè)DNALadder檢測(cè)熒光法檢測(cè)凋亡鑒定方法2.2流式細(xì)胞技術(shù)的一般原理及應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry)是以流式細(xì)胞儀(flowcytometer，F(xiàn)CM)為工具，在液流系統(tǒng)中對(duì)懸液中的單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞器或生物粒子的生物、物理和化學(xué)特性進(jìn)行快速測(cè)量并自動(dòng)分析，并根據(jù)這些特性將所需要的細(xì)胞或細(xì)胞器從群體中加以分類(lèi)收集的高技術(shù)。它的主要特點(diǎn)是，可以在單細(xì)胞水平上對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、多參數(shù)的定量分析及分選，借此判斷細(xì)胞的體積、DNA含量、蛋白質(zhì)含量、酶活性、細(xì)胞膜受體和表面抗原等許多重要參數(shù)，并可在無(wú)菌狀態(tài)下，對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)收集，收集的純度可達(dá)99％。

流式細(xì)胞儀工作原理

流式細(xì)胞儀（FlowCytometer）集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。散射光信號(hào)FALS

SensorLaser散射光信號(hào)RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter） 細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC,SideScatter） 細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對(duì)復(fù)雜性外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖（紅細(xì)胞溶解后）流式細(xì)胞儀的檢測(cè)信號(hào)熒光信號(hào)使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量熒光信號(hào)雙色直接染色數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)存儲(chǔ):LISTMODE數(shù)據(jù)顯示: 直方圖(Histogram) 二維點(diǎn)圖(DotPlot) 等高線圖(ContourPlot) 密度圖(Density) 三維圖（3DPlot）等數(shù)據(jù)分析直方圖分析數(shù)據(jù)分析點(diǎn)圖分析數(shù)據(jù)分析等高圖和密度圖分析2.3數(shù)用流坦式細(xì)胞敏術(shù)檢測(cè)艇細(xì)胞凋理亡的原邀理利用流式雹細(xì)胞儀測(cè)嗽定細(xì)胞光昌散射可對(duì)從凋亡細(xì)胞縱進(jìn)行分析育。凋亡早辱期細(xì)胞因腦體積減小攻，胞漿及車(chē)染色質(zhì)固找縮，F(xiàn)S羞C變小，廉SSC增險(xiǎn)大，凋亡贊晚期細(xì)胞前FSC、愈SSC均槽變小，壞掏死細(xì)胞則棒因細(xì)胞膜襯通透性改乘變，細(xì)胞恒腫脹，F(xiàn)蟲(chóng)SC、S捉SC變大逼，胞膜破轎裂，胞內(nèi)挨含物釋出肥后FSC勞、SSC老均變小。用流式細(xì)顏胞儀也可促以根據(jù)D說(shuō)NA含量離不同，從圾細(xì)胞群體荷中鑒別凋睬亡細(xì)胞。超凋亡細(xì)胞高在G1峰酬前出現(xiàn)亞鹽二倍體峰料，即凋亡木峰（Ap吃峰）。通盼過(guò)此峰下嚼的面積值餅可得出凋要亡細(xì)胞在貼所測(cè)細(xì)胞述群中所占辦的比率（下用凋亡軟過(guò)件定量）犧。另外，細(xì)交胞凋亡受暖基因調(diào)控穿，有賴(lài)于赴某些蛋白佳質(zhì)的合成休，用流式慈細(xì)胞儀可雖同時(shí)測(cè)定此凋亡細(xì)胞屆的FSC相/SSC翼及DNA區(qū)/蛋白質(zhì)巡壽，進(jìn)行多浴參數(shù)分析糠以研究不捐同的凋亡跡誘導(dǎo)作用側(cè)機(jī)制。3.實(shí)驗(yàn)怒材料、用悲品實(shí)驗(yàn)材硬料：培慶養(yǎng)的H姥ela棍細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用品展：①儀器與然用具C02陵培養(yǎng)箱途，超凈壓工作臺(tái)蓮，倒置扶顯微鏡屈和離心盤(pán)機(jī)等。微量加樣受器(1μ礎(chǔ)l-1m稍l)，0椅.5m銳l和1.餃5ml序的Epp絞endo潛rf管，壩20μl掌、200箭μl和1醒ml吸頭痛，10m淚l培養(yǎng)瓶呀，載玻片捆，蓋玻片駝等。②試劑放射線菌謊素D（誘亭導(dǎo)細(xì)胞凋拍亡的腫瘤沉治療藥物如，如喜樹(shù)北堿、紫杉洗醇、中藥饑砒霜等）澇；熒光探幟針：用P滑BS(p初H7.4砌)將PI姿配成50現(xiàn)0μg級(jí)/ml的友貯液，在碗-20℃統(tǒng)凍存。FACS診Cali錘bur,根BD嫁Bios胳cien暫ce4.實(shí)育驗(yàn)步驟Hela援細(xì)胞的傳元代培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)翼胞凋亡套：向?qū)Τ?shù)生長(zhǎng)賢期細(xì)胞耗中加入響放射線知菌素D依（可結(jié)潔合科研拐采用其尤他誘導(dǎo)破細(xì)胞凋浮亡的腫模瘤治療補(bǔ)藥物）陪分別為傷0.2勸5、0蹄.5、血1、2特、4m剖g/L站,作膝用6小究時(shí)。用胰酶驗(yàn)消化以仆上五個(gè)鐵樣本以木及對(duì)照粉的細(xì)胞緣瑞，吹打泄收集于罩離心管欣中，1濤000叔r/m陡in下乏離心8腥分鐘，烤倒去上舒清。加約1m均lPB忠S重懸細(xì)傻胞，用注康射器迅速室注入到4浩ml4℃題的70%壘的酒精中到，固定8父小時(shí)以上午。去上清覺(jué)，用P鄉(xiāng)豐BS嬌4ml趴重懸細(xì)滑胞，再巨100酬0r/超min貞下離心襯8分鐘醒，去上堅(jiān)清控干洋液體后動(dòng)加0.還3ml秧PBS扁，加撕入RN沿A酶A冒至終濃五度為5規(guī)0ug仇/ml肚，37幕℃孵育倘30分誕鐘。將樣品槐插到冰挨浴中，貧停止酶常的作用結(jié)。待冷臥卻后加唉入50倡ug/適ml穗的PI憑1.內(nèi)5ml任,放于吳冰上在絮冰箱中而染色至肅少30梅分鐘。3個(gè)小筋時(shí)之內(nèi)脫在流式奮細(xì)胞儀葉上檢測(cè)效樣品。5.實(shí)隙驗(yàn)結(jié)果正常凋亡化療前隨后胃癌壟活檢標(biāo)板本中C底asp寄ase掠-3+挪細(xì)胞化療前(爆3.49朝%)化療后叮(94癢.86驢%)26Key粉lab暴of吸Me缺dic詳ine桃Sc枝hoo喂lo糖fS凡uZ頂hou喂Un階ive彩rsi鏡ty細(xì)胞凋亡允——PI痕分析PI-Flu距ore濃sce般nce#Ev冒ents凋亡細(xì)率胞正常G階0/G垮1期細(xì)爆胞6.掩注意事俗項(xiàng)細(xì)胞數(shù)賠目要充商分；為搜防止細(xì)府胞成團(tuán)治，可在植用流式教檢測(cè)前毒用篩網(wǎng)男過(guò)濾?？山Y(jié)合像科研，騙將課題另組項(xiàng)目洋中研究除的一些宏凋亡誘噸導(dǎo)劑作啄為研究蠅對(duì)象進(jìn)堂行分析炮。并在鑼此綜合奴實(shí)驗(yàn)中粱掌握動(dòng)拾物細(xì)胞潔的傳代啦技術(shù)，送細(xì)胞凋蓋亡的形子態(tài)學(xué)分奴析及流刑式細(xì)胞落技術(shù)。7.思考屆題制備流虎式樣品碗需要注釋意哪幾釋點(diǎn)。還有哪些鍵檢測(cè)細(xì)胞層凋亡的方注法？謝謝觀閥看/歡迎下側(cè)載BY稱(chēng)FAI卸TH浮IM縱EAN因A精VIS心ION渣OF釣GO債OD屬ONE諒CH檢ERI壘S