激光掃描共聚焦顯微鏡研究生演示文稿

激光掃描共聚焦顯微鏡研究生演示文稿目前一頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)激光掃描共聚焦顯微鏡研究生目前二頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)

激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）

目前三頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)

授課內(nèi)容

一、LSCM的發(fā)展與現(xiàn)狀

二、LSCM的成像原理及組成

三、LSCM的使用步驟四、LSCM的基本功能

五、LSCM在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用目前四頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)

1957年，MarvinMinsky提出共聚焦原理；1978年，Brandengoff在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度的共聚焦顯微鏡；1982年，BIO-RAD公司第一個(gè)推出商品化激光掃描共聚焦顯微鏡；

1985年，WijnaendtsVanResandt發(fā)表了第一篇有關(guān)激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學(xué)中應(yīng)用的文章；1987年，發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。一、激光掃描共聚焦顯微鏡發(fā)展與現(xiàn)狀目前五頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)儀器名稱生產(chǎn)商型號BD高通量活細(xì)胞共聚焦分析系統(tǒng)400系列

美國BD公司

Pathway415、Pathway435

BD高通量活細(xì)胞共聚焦分析系統(tǒng)800系列

美國BD公司

800系列

BD全光譜活細(xì)胞共聚焦高速掃描系統(tǒng)

美國BD公司

CARVⅡ

尼康共焦顯微鏡

尼康（Nikon)

C1

共焦激光掃描顯微鏡

徠卡儀器有限公司Leica

TCS-SP2

OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡

OLYMPUS

FV300

OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡

OLYMPUS

FV1000

NIKON共聚焦顯微鏡

尼康（nikon)

尼康（nikon）C1-plus

UltraView?高速掃描型激光共聚集系統(tǒng)

PerkinElmer

UltraView?

高通量共聚焦顯徽細(xì)胞圖像分析測定系統(tǒng)

GEHealthcare

INCellAnalyzer3000

時(shí)間分辨激光共聚焦顯微成像系統(tǒng)

德國耶萊公司

TauMap

德國ZEISS激光共聚焦顯微鏡

德國ZEISS

LSM510SYSTEM

德國ZEISS激光共聚焦顯微鏡

德國ZEISS

LSM510PASCALSYSTEM

目前六頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)FluoView?FV1000共聚焦顯微鏡

FV1000系統(tǒng)完美地整合了兩套相互獨(dú)立的掃描模塊在一套系統(tǒng)內(nèi)，在一束激光進(jìn)行實(shí)驗(yàn)刺激的同時(shí)，另一束激光實(shí)時(shí)地對樣品進(jìn)行掃描，從而記錄完整的動(dòng)態(tài)變化過程。

美國Meridian公司的ACASuLTIMA312為同類儀器中檔次最高、功能最全的精密儀器。它能達(dá)到每秒120幅畫面的高速掃描激光共聚焦觀察，可提供實(shí)時(shí)，真彩色的激光共聚焦原色圖象。

BIO-RAD公司第七代Radiance

2100型激光掃描共聚焦顯微鏡是全世界唯一無需人工調(diào)整的激光掃描共聚焦掃描顯微鏡

目前七頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前八頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)

1）激光光源

2）計(jì)算機(jī)系統(tǒng)

3）共聚焦系統(tǒng)4）光學(xué)探測系統(tǒng)

5）圖像分辨率

6）掃描方式激光掃描共聚焦顯微鏡硬件和軟件系統(tǒng)硬件系統(tǒng)軟件系統(tǒng)1）、ImageAnalyze2）、RatioAnalysis和Kinetics3）、Cell–CellCommunicationandFRAP4）、CellList5）、CellSorting6）、ConfocalImaging目前九頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)Mitoticcells,multiplefluorescence(NCIMaryland)

目前十頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)

激光掃描共聚焦顯微鏡（LaserScanningConfocalMicroscopy，簡稱LSCM）是近代生物醫(yī)學(xué)圖象儀器的最重要發(fā)展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖象，以及在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細(xì)胞形態(tài)的變化等。已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)、解剖學(xué)、胚胎學(xué)、免疫學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域，對生物樣品進(jìn)行定性、定量、定時(shí)和定位研究具有很大的優(yōu)越性，成為這些領(lǐng)域新一代強(qiáng)有力的研究工具。

二、激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理及組成目前十一頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)1、LSCM的基本結(jié)構(gòu)

熒光顯微鏡系統(tǒng)及樣品臺(tái)

激光光源掃描器圖象存儲(chǔ)及處理系統(tǒng)

LSCM各部分相互關(guān)系示意圖

計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)

控制

目前十二頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)共聚焦顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的比較

計(jì)算機(jī)數(shù)字圖象處理分析系統(tǒng)普通光學(xué)顯微鏡場光源干擾激光掃描共聚焦顯微鏡激光光源共軛聚焦原理和裝置照相目前十三頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)LightMicroscopy

AC.elegansEmbryoGatpro-nucleimeetingGstage(beforedividinginto2-cellembryo)

DifferentialInterferenceContrast

(DIC;Nomarski)LaserScanningConfocalMicroscopy(LSCM)MultiphotonFluorescenceExcitationMicroscopy(MPFE)目前十四頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)2、LSCM的工作原理激光束掃描器接收器計(jì)算機(jī)載物臺(tái)的升降“光學(xué)切片”

“細(xì)胞CT”

目前十五頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)

LSCM組成光路的示意圖

目前十六頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)

Beampathintheconfocallaserscanningmicroscope

目前十七頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)共聚焦原理示意圖目前十八頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前十九頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)（一）激光光源

（1）、激光譜線（2）、激光器開閉和電壓調(diào)節(jié)（3）、激光強(qiáng)度回饋穩(wěn)定電路設(shè)計(jì)（4）、輔助設(shè)備目前二十頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)波長（nm）功率(mW)激光器類型32510～30氦鎘(He-Cd)激光351300帶紫外的水冷式氬離子激光364>20風(fēng)冷氬離子激光（Ar-ion）44211氦鎘激光457～51425小型氬離子激光5431.25綠氦－氖(He-Ne)激光63033外諧振器半導(dǎo)體激光6303碰撞脈沖染料激光6323.5氦－氖激光700～11002000藍(lán)寶石激光11521氦－氖激光目前二十一頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)（二）掃描器

掃描器針孔光欄（pinhole）分光鏡發(fā)射熒光分色鏡檢測器目前二十二頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)1）針孔光欄2）分光鏡作用位置位置作用目前二十三頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)3）發(fā)射熒光分色鏡4）檢測器位置作用位置作用目前二十四頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)光束掃描臺(tái)階掃描掃描方式

原理優(yōu)缺點(diǎn)目前二十五頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)激光共聚焦顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)目前二十六頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)掃描系統(tǒng)

（1）、激光掃描系統(tǒng)通過照相通道或熒光通道和顯微鏡相連，與所接顯微鏡一體化設(shè)計(jì)（2）、檢測器數(shù)量（3）、共聚焦針孔（4）、掃描分辨率及灰度級（5）、連續(xù)分光設(shè)計(jì)系統(tǒng)（或其它光譜分離系統(tǒng)）50-300微米（6）、光譜掃描功能（7）、掃描速度及速度調(diào)節(jié)目前二十七頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)（8）、掃描方式XYZtλ任意組合

①點(diǎn)掃描②線掃描③Xλ掃描④平面掃描⑤XYλ、XZλ掃描⑥xyz,xyzt掃描⑦局部放大掃描⑧光譜模式下，多通道同時(shí)掃描。（9）、掃描旋轉(zhuǎn)、光學(xué)放大（變倍）（10）、可即時(shí)或延時(shí)進(jìn)行掃描（11）、有線和幀方式的多重掃描功能ROI(regionofinteresting，感興趣區(qū)域）實(shí)時(shí)（realtime）顯示目前二十八頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)（12）、在改變掃描分辨率及掃描速度等后，無須很復(fù)雜地對儀器參數(shù)重新設(shè)置（13）、有記憶功能（14）、有專用的圖象數(shù)據(jù)庫（15）、系統(tǒng)采用模塊化設(shè)計(jì)，便于整個(gè)系統(tǒng)的擴(kuò)展和升級換代目前二十九頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前三十頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)Drosophilaembryo,brain,3DProjection-"extendeddepthoffocus“(Prof.Reichert,LaborNeurobiologieUniversityofBasel)目前三十一頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)（三）光學(xué)系統(tǒng)（顯微鏡）⑴、倒置熒光萬能顯微鏡⑵、顯微鏡上的外接接口⑶、熒光顯微鏡的載物臺(tái)上裝有微量步進(jìn)馬達(dá)⑷、熒光鏡座要裝有防振動(dòng)裝置⑸、裝有光路轉(zhuǎn)換裝置⑹、配備高數(shù)值孔徑的油浸或水浸物鏡⑺、載物臺(tái)支架和附件的配置目前三十二頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)(10)、≥4位顯微鏡熒光濾色片組，置換方便，覆蓋紫外和可見光波長⑼、熒光顯微鏡的參數(shù)要與光路系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)控制軟件系統(tǒng)相匹配⑻、汞燈光線的強(qiáng)度可調(diào)目前三十三頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前三十四頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)

熒光源

單光子激勵(lì)（左），多光子激勵(lì)（右）激發(fā)熒光能量圖目前三十五頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)單光子（λ1）單光子（λ2）雙光子（λ2）單、雙光子激發(fā)產(chǎn)生熒光過程的示意圖

熒光熒光目前三十六頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)

熒光光譜

目前三十七頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前三十八頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)

分隔發(fā)射的熒光

目前三十九頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)

Separationoffluorescenceemissionsbymeansofdichroicfilters目前四十頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)（四）計(jì)算機(jī)系統(tǒng)控制硬件的軟件功能：

①控制電動(dòng)顯微鏡；②選擇激光波長，調(diào)節(jié)激光強(qiáng)度；③拍攝2-5維圖像；④選擇光譜拍攝范圍，分辨率，激發(fā)光擋片位置。目前四十一頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)應(yīng)用軟件功能（圖象處理、數(shù)據(jù)分析、生物學(xué)應(yīng)用等）：①多通道疊加，三維重建，旋轉(zhuǎn)，生成AVI文件，Average拍攝模式提高信噪比；②熒光強(qiáng)度動(dòng)態(tài)分析，動(dòng)態(tài)顯示，Ratio值測量（鈣離子等）；③FRAP/FLIP；④線性光譜拆分，自定義染料光譜數(shù)據(jù)庫，背景扣除；⑤圖像調(diào)節(jié)亮度，對比度，Gamma；單個(gè)通道分別調(diào)節(jié)或多個(gè)通道同時(shí)調(diào)節(jié)；⑥圖像處理：旋轉(zhuǎn)，裁剪，多種濾鏡（Kirsh/Laplace/Lowpass/Median），添加標(biāo)尺，箭頭，文字等；⑦圖像分析：直方圖，距離，強(qiáng)度，強(qiáng)度斷面分布；⑧VBA模塊：宏功能，可以錄制，編輯，回放，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)操作；⑨多種視圖：1D，2D，正交視圖，圖片疊加等；⑩光譜分析具有多種方式選擇，支持盲法拆分，方便用戶使用；⑾具有專業(yè)的FRAP（熒光漂白），F(xiàn)RET（熒光能量共振轉(zhuǎn)移）軟件包。

目前四十二頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前四十三頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)三、激光掃描共聚焦顯微鏡的使用步驟（一）樣品制備

1．組織切片標(biāo)本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本要求單層，并能很好地貼附在樣品池中。所以，組織標(biāo)本無論是石蠟切片還是冰凍切片，均為越薄越好。2．細(xì)胞標(biāo)本細(xì)胞種類和純度，細(xì)胞密度和形態(tài)。3．承載細(xì)胞的器皿Petri皿和玻片。目前四十四頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前四十五頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)（二）熒光探針的選擇標(biāo)記生物樣品的探針大約分為：1）蛋白質(zhì)、單糖和多糖探針；2）細(xì)胞器探針；3）核酸探針；4）細(xì)胞活性探針；5）膜和受體探針；6）細(xì)胞膜電位和細(xì)胞內(nèi)pH探針；7）金屬探針；8）分子的特殊基團(tuán)結(jié)合探針；9）其他目前四十六頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前四十七頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前四十八頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)（4）、按軟件要求設(shè)置有關(guān)參數(shù)，進(jìn)行觀察和分析。（三）儀器使用步驟（1）、選擇激光器類型（2）、選擇相應(yīng)的濾片（3）、根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)軟件目前四十九頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)Xy觀察模式的圖象獲得設(shè)置染色方法顯微鏡和掃描的配置設(shè)置物鏡放大率設(shè)置變焦率為1x設(shè)置所需通道設(shè)置最高掃描速度設(shè)置xy觀察模式執(zhí)行重復(fù)掃描校正對于確定z位置觀察所需復(fù)合的各部分條件設(shè)置觀察范圍校正圖象亮度設(shè)置較低的掃描速度重新校正圖象亮度停止重復(fù)掃描獲得圖象儲(chǔ)存圖象目前五十頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前五十一頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前五十二頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前五十三頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)1）DNA用Hoechst33342標(biāo)記（藍(lán)），2）細(xì)胞膜用NBD-PC染色（綠），3）線粒體用Mitotracker標(biāo)記（紅）三重?zé)晒馊旧珗D譜：活HT細(xì)胞目前五十四頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)1、“更多信號！”

1）、通過減慢掃描速度2）、使用“平均”方法3）、增加發(fā)射濾鏡的帶寬4）、加大針孔直徑；注意：光學(xué)切片的厚度也會(huì)相應(yīng)地增大。5）、增大激發(fā)能（激光功率）；注意：漂白效應(yīng)、飽和效應(yīng)和光毒效應(yīng)。如何改善圖像質(zhì)量目前五十五頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)3、“更可靠！”

1）、使用多軌2）、提供預(yù)定義配置。3）、可同時(shí)定義和使用任何形狀的多個(gè)研究區(qū)。2、“更多細(xì)節(jié)！”

1）、使用較高數(shù)值孔徑(NA)的物鏡2）、增加“幀大小”=每條線的像素值+每幀的線條數(shù)3）、優(yōu)化掃描焦距(Z)4）、增加動(dòng)態(tài)范圍目前五十六頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前五十七頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前五十八頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)Culturedcells,multiplefluorescence(Prof.Wunderli-Allenspach,ETHZürich)Cellculture,3Dshadowprojection(calculatedby"Imaris",BitplaneAG,Zürich)showingtightjunctions(red)andcytoskeletonstructures(green)(Prof.Wunderli-Allenspach,ETHZürich)目前五十九頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)四、激光掃描共聚焦顯微鏡的基本功能

主要功能

采集圖像定量測定相關(guān)參數(shù)熒光信號定性定位觀察目前六十頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)（一）采集和處理圖像

1、無損傷逐層掃描樣品采集二維及三維熒光圖像LSCM的成像特點(diǎn)：（1）、保持樣品的完整性。（2）、采集多重（波長）熒光分解及合成（overlay）圖像。（3）、所采集的熒光圖像比普通熒光顯微鏡質(zhì)量好，更利于形態(tài)學(xué)觀察。（4）、可以只選擇出樣品中感興趣的區(qū)域（regionsofinterest，ROI）和深度進(jìn)行掃描。（5）、獲取三維重建圖像2、獲取透射光及反射光圖像有、無熒光的樣品均可以用LSCM采集到其透射光圖像。目前六十一頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)（二）熒光分子的定性及定位1、定性鑒定待測熒光物質(zhì)2、熒光信號的定位（1）、單熒光定位（2）、多重?zé)晒鈽?biāo)記共定位（3）、熒光與透射光共定位目前六十二頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)Confocalmicrographofmilkshowingmilkprotein(green),fat(blue),sugarcrystals(black)andcocoasolids(red).Bar=25mm目前六十三頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前六十四頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前六十五頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前六十六頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)（三）定量測定LSCM將所采集的共聚焦圖像中的相關(guān)信息轉(zhuǎn)化為定量數(shù)據(jù)，即稱之為定量測定。（1）圖像中的任意區(qū)域（或線）的熒光強(qiáng)度。（2）熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間、空間和波長的變化曲線和數(shù)據(jù)。（1）圖像中的任意區(qū)域（或線）的熒光強(qiáng)度（3）圖像內(nèi)的幾何參數(shù)，包括面積、厚度、空間距離、體積等。按照定量測定中是否含有時(shí)間控制程（t），將掃描模式分為動(dòng)態(tài)檢測和靜態(tài)測量。目前六十七頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)目前六十八頁\總數(shù)七十九頁\編于一點(diǎn)ThefigureshowsCa2+responsetoNAADPuncaginginmatureAsterinapectiniferaoocytesmeasuredwithconfocalmicroscope.目前六十九頁\總數(shù)