課題 制備和應(yīng)用固定化酶

課題制備和應(yīng)用固定化酶第1頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四1.直接應(yīng)用酶生產(chǎn)的缺點。2.固定化酶的概念及優(yōu)點。3.固定化酶的方法。4.固定化酶多采用的方法及原因。5.固定化細(xì)胞的優(yōu)點和缺點。6.固定化細(xì)胞常用的方法及原因。7.活化酵母細(xì)胞的含義及注意事項。8.配制CaCl2溶液的注意事項。9.配制海藻酸鈉溶液的加熱方法及海藻酸鈉濃度過高和過低造成的后果。10.海藻酸鈉溶液與酵母細(xì)胞混合的注意事項。第2頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四思考：直接應(yīng)用酶生產(chǎn)的缺點？一、固定化酶技術(shù)

酶的穩(wěn)定性差，通常在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和重金屬離子等因素的影響下容易失活；

溶液中的酶很難回收,不能被再次利用,提高了生產(chǎn)成本;反應(yīng)后酶會混在產(chǎn)物中,可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。(一)固定化酶技術(shù)產(chǎn)生背景：第3頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四2、固定化酶技術(shù)的優(yōu)點：將酶固定在不溶于水的載體上,使酶既能與反應(yīng)物接觸,又能與產(chǎn)物分離,可以被反復(fù)利用。微生物產(chǎn)生的酶，可以分為分泌在細(xì)胞外的胞外酶和包含在細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)酶。利用胞內(nèi)酶時，需要采用手段將細(xì)胞破碎后，將酶進(jìn)行分離純化，提取后酶的活性和穩(wěn)定性往往都受到很大的影響。(二)固定化酶技術(shù)1、固定化酶概念：第4頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四3、固定化酶應(yīng)用實例：應(yīng)用固定化酶技術(shù)生產(chǎn)高果糖漿①生產(chǎn)原料:葡萄糖②生產(chǎn)機(jī)理：經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶的異構(gòu)作用，將一部分葡萄糖轉(zhuǎn)化成果糖，由葡萄糖和果糖而組成的一種混合糖糖漿。高果糖漿是指果糖含量為42%左右的糖漿。第5頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四使用固定化酶技術(shù)，將葡萄糖異構(gòu)酶固定在一種顆粒狀的載體上，再將這些酶顆粒裝到一個反應(yīng)柱內(nèi)，柱子底端裝上分布著許多小孔的篩板。酶顆粒無法通過篩板上的小孔，而反應(yīng)液卻可以自由出入。生產(chǎn)過程中，將葡萄糖溶液從反應(yīng)柱的上端注入，使葡萄糖溶液流過反應(yīng)柱，與固定化葡萄糖異構(gòu)酶接觸轉(zhuǎn)化成果糖，從反應(yīng)柱的下端流出。③生產(chǎn)過程第6頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四④生產(chǎn)優(yōu)點反應(yīng)柱能連續(xù)使用半年，大大降低了生產(chǎn)成本，提高了果糖的產(chǎn)量和質(zhì)量。第7頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四4、固定酶(或細(xì)胞)的方法：包括包埋法、化學(xué)結(jié)合法(將酶分子或細(xì)胞相互結(jié)合，或?qū)⑵浣Y(jié)合到載體上)和物理吸附法。(1)包埋法①定義：將酶或細(xì)胞包埋在不溶于水的多孔性載體中，包埋成格子型或包埋成微膠囊型。②載體：明膠、瓊脂糖、海藻酸鈉、醋酸纖維素和聚丙烯酰胺。第8頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四交聯(lián)法：通過雙功能試劑，將酶和酶聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的方法。(2)化學(xué)結(jié)合法①定義：將酶分子或細(xì)胞相互結(jié)合，或?qū)⑵浣Y(jié)合到纖維素、瓊脂糖，離子交換樹脂等載體上的固定方式。②種類共價結(jié)合法：酶和載體以共價鍵的形式結(jié)合在一起的方法，這種方法需要酶和載體都具有氨基、羧基或羥基等官能團(tuán)。第9頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四(3)物理吸附法：將酶吸附到固體吸附劑表面的方法，固體吸附劑多為活性碳、多孔玻璃等。說明：酶和細(xì)胞固定方法的選擇:(1)方法：①酶更適合采用化學(xué)結(jié)合和物理吸附法固定化②細(xì)胞多采用包埋法固定化(2)原因：細(xì)胞個大，酶分子很??；個體大的細(xì)胞難以被吸附或結(jié)合，而個小的酶容易從包埋的材料中漏出。第10頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四酶的幾種固定方式將酶吸附在載體表面上（物理吸附法）將酶相互連接起來（化學(xué)結(jié)合法）將酶包埋在細(xì)微網(wǎng)格里（包埋法）第11頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四第12頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四二、固定化細(xì)胞技術(shù)1、優(yōu)點和缺點：

將合成酶的細(xì)胞直接固定。與固定化酶技術(shù)相比,固定化細(xì)胞制備的成本更低、周期短、產(chǎn)量大、操作更容易，固定一系列酶，対酶活性影響更小。將微生物細(xì)胞限制或定位于特定空間位置，即將微生物制成固定化細(xì)胞后，能避免復(fù)雜的細(xì)胞破碎、酶的提取和純化過程，因而固定化細(xì)胞內(nèi)酶的活性基本沒有損失。固定后的微生物細(xì)胞可以作為固體催化劑催化一系列反應(yīng)，同時，催化反應(yīng)結(jié)束后又能被回收和重復(fù)利用。第13頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四

固定化細(xì)胞操作容易、對酶活性的影響更小、可以催化一系列的反應(yīng)、容易回收等，但由于大分子物質(zhì)難以自由通過細(xì)胞膜，因此固定化細(xì)胞的應(yīng)用也受到限制。思考：根據(jù)所學(xué)課本內(nèi)容想一想，固定化酶技術(shù)和固定化細(xì)胞技術(shù)這兩種技術(shù)中哪種技術(shù)先發(fā)展起來的？第14頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四2、固定化細(xì)胞的方法：

吸附法和包埋法。常用的方法是包埋法。原因：細(xì)胞個大，酶分子很??；個體大的細(xì)胞難以被吸附或結(jié)合，而個小的酶容易從包埋的材料中漏出。第15頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四三、酵母細(xì)胞的固定化技術(shù)選用海藻酸鈉作載體包埋酵母細(xì)胞1、酵母細(xì)胞的活化①過程：稱取1g干酵母，放入50ml的小燒杯中，加入蒸餾水10ml。用玻璃棒攪拌，使酵母細(xì)胞混合均勻，成糊狀，放置1h左右，使其活化

活化：在缺水狀態(tài)下，微生物處于休眠狀態(tài)?；罨褪亲屘幱谛菝郀顟B(tài)的微生物重新恢復(fù)正常的生活狀態(tài)。第16頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四第17頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四酵母細(xì)胞所需要的活化時間較短，一般需要0.5～1h，需要提前做好準(zhǔn)備。此外，酵母細(xì)胞活化時體積會變大，因此活化前應(yīng)該選擇體積足夠大的容器，以避免酵母細(xì)胞的活化液溢出容器外。②注意事項第18頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四2、配制物質(zhì)的量濃度為0.05mol/L的CaCl2溶液①過程：稱取無水CaCl20.83g，放入200ml的燒杯中，加入150ml的蒸餾水，使其充分溶解，待用。②注意事項：溶解物質(zhì)要徹底，勿用自來水溶解，以防自來水中各種離子影響實驗結(jié)果。第19頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四3、配制海藻酸鈉溶液①過程：稱取0.7g海藻酸鈉，放入50ml小燒杯中，加入10ml水，用酒精燈加熱，邊加熱邊攪拌，將海藻酸鈉調(diào)成糊狀，直至完全溶化，用蒸餾水定容至10ml。這是實驗中最重要的一環(huán)，是實驗成敗的關(guān)鍵。第20頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四②注意事項加熱時要用()，或者()，反復(fù)幾次，直到海藻酸鈉溶化為止。小火間斷加熱海藻酸鈉的濃度涉及到固定化細(xì)胞的質(zhì)量。如果海藻酸鈉濃度過高，將很難形成凝膠珠；如果濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酵母細(xì)胞的數(shù)目少。第21頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四4、海藻酸鈉溶液和酵母細(xì)胞混合①過程:將溶化好的海藻酸鈉溶液冷卻至室溫，加入以活化的酵母細(xì)胞，進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，再轉(zhuǎn)移至注射器中第22頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四②注意事項A、溶化好的海藻酸鈉溶液必須冷卻至室溫，否則會因溫度過高殺死酵母菌。B、攪拌要徹底充分，使兩者混合均勻，以免影響實驗結(jié)果的觀察。第23頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四5、固定化酵母細(xì)胞①過程：以恒定的速度緩慢的將注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，將形成的凝膠珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。②CaCl2溶液作用海藻酸鈉膠體在CaCl2這種電解質(zhì)的作用下，發(fā)生聚沉，形成凝膠珠，需穩(wěn)定30min左右。第24頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四6、用固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵①將固定化酵母細(xì)胞（凝膠珠）用蒸餾水沖洗2－3次，洗去凝膠珠表面多余的電解質(zhì)溶液。過程②見課本“發(fā)酵麥芽汁”思考：在發(fā)酵時，麥芽汁的濃度不能太高，為什么？濃度太高會使酵母細(xì)胞因失水過多而死亡。第25頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四(一)觀察凝膠珠的顏色和形狀如果制作的凝膠珠顏色過淺、呈白色，說明海藻酸鈉的濃度偏低，固定的酵母細(xì)胞數(shù)目較少；如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說明海藻酸鈉的濃度偏高，制作失敗，需要再作嘗試。(二)觀察發(fā)酵的葡萄糖溶液利用固定的酵母細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)生酒精，可以看到產(chǎn)生了很多氣泡，同時會聞到酒味四、課題成果評價第26頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四鞏固練習(xí)1、酶固定化技術(shù)與細(xì)胞固定化技術(shù)的關(guān)系是A酶固定化技術(shù)是細(xì)胞固定化技術(shù)的基礎(chǔ)B細(xì)胞固定化技術(shù)是酶固定化技術(shù)的基礎(chǔ)C酶固定化技術(shù)與細(xì)胞固定化技術(shù)是同時發(fā)展起來的D固定化細(xì)胞技術(shù)先于酶固定化技術(shù)第27頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四2、固定化酶技術(shù)常采用A包埋法B化學(xué)結(jié)合和物理吸附法C活化法D微囊化法3、海藻酸鈉在水中溶解的速度較慢，需要經(jīng)過加熱促進(jìn)其溶解，采用的最好加熱方法是A快速加熱B持續(xù)高溫加熱C小火間斷加熱D灼燒加熱第28頁，共30頁，2023年，2月20日，星期四4、酵母菌的活化是指A讓酵母細(xì)胞恢復(fù)運動狀態(tài)B讓酵母細(xì)胞在缺水