第五章色譜分離法新2

吸附色譜排阻色譜（凝膠色譜）分配色譜離子交換色譜吸附能力的差異分子尺寸的大小不同兩相中分配系數的不同親和力的差異AdsorptionchromatographyExclusionchromatographyGel-permeationchromatographyPartitionchromatographyIon-exchangechromatography色譜分離法的分類（原理）目前一頁\總數九十六頁\編于八點§5－1紙色譜法紙色譜法：以濾紙吸附的水作固定相，有機溶劑作流動相的一種色譜法。目前二頁\總數九十六頁\編于八點§5－1紙色譜法一、基本原理和特點二、定性分析三、操作技術四、應用目前三頁\總數九十六頁\編于八點一、基本原理和特點基本原理：它和萃取一樣，它也是根據不同物質在兩相間的分配比不同而進行分離的（相當于逆流萃?。┨攸c：操作簡單、分離效率高，但分離速度慢。目前四頁\總數九十六頁\編于八點1.層析缸123456732.濾紙3.原點4.展開劑5.前沿6.7.斑點目前五頁\總數九十六頁\編于八點二、定性分析

組分分離后，它們在濾紙上的位置用比移值來表示，它也是色譜定性分析的依據。aABbl

將標準和樣品的Rf值進行比較，可以對樣品進行定性分析。定性分析方法：目前六頁\總數九十六頁\編于八點二、定性分析影響比移值的因素：1）欲分離物的本性:物質在兩相的分配系數,決定了它的Rf大小2)層析溶劑:同一組分在不同溶劑中Rf不同。通常應選這樣的層析劑，使溶質的Rf在0.050.85之間,不同組分的Rf差值>0.05.3）pH:影響它們的存在狀態(tài)目前七頁\總數九十六頁\編于八點二、定性分析4）濾紙:質地均一、厚薄適當、具有一定機械強度、不含雜質5）溫度:溫度會影響溶質的分配系數及流動相的擴散速度。層析操作應在恒溫下進行，溫度不超過±0.5oC6）展開方式:展開方式不同,Rf也不同。下行法的Rf最大，上行法的Rf較小，環(huán)行法的Rf也不大。目前八頁\總數九十六頁\編于八點三、操作技術1.濾紙的選擇和處理2.固定相的選擇3.試樣的制備和點樣4.展開5.顯色目前九頁\總數九十六頁\編于八點1.濾紙的選擇與處理濾紙的選擇：

a.要求濾紙質地均勻、平整無折痕邊緣整齊

b.要求濾紙的纖維松緊適宜

c.濾紙的雜質含量少

以0.1～0.4mol/LHCl(或2mol/LHAc)浸泡數小時,除去無機雜質后,取出用蒸餾水洗凈,再將濾紙放在丙酮-乙醇(1:1)中浸泡一周時間,除去有機雜質,再取出風干備用.濾紙的處理目前十頁\總數九十六頁\編于八點2.固定相的選擇

紙層析——以吸著在纖維素上的水作固定相。反相紙層析——用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇等作固定相。若分離芳香油等非極性物，以石蠟油、硅油作固定相。目前十一頁\總數九十六頁\編于八點3.試樣的制備和點樣A.試樣的制備

固體試樣盡量不用水來溶解，而多采用乙醇、丙酮、氯仿等有機溶劑來溶解，最好采用與展開劑極性相似的溶劑。液體試樣可直接點樣。

?。┫扔勉U筆在距紙條一端2~3cm處劃一條直線（起始線）并在線上隔一定距離劃一“x”號表示點樣位置；見下示意圖：B.點樣方法目前十二頁\總數九十六頁\編于八點3.試樣的制備和點樣目前十三頁\總數九十六頁\編于八點3.試樣的制備和點樣ⅱ）點樣工具：微量注射器、毛細滴管（Φ＝0.5mm)

；ⅲ）點樣方法：用點樣工具吸取試液輕輕與“x”號接觸，使點樣的斑點直徑為0.2~0.5cm,每次點樣2~20μL于濾紙上，以冷風吹干；ⅳ）干后，將紙的兩邊用線縫好，以圓筒形式置于層析缸中展開。目前十四頁\總數九十六頁\編于八點4.展開欲分離物在兩相中的溶解度；展開劑的極性展開劑與欲分離物間應無化學反應欲分離物在展開劑中的分配系數最好不受溫度的影響欲分離物在兩相間的分配平衡瞬間達到A.展開劑的選擇目前十五頁\總數九十六頁\編于八點4.展開B.展開方法

展開前，層析缸與已點樣濾紙必須預先經水蒸汽、溶劑蒸氣飽和。方法：將溶劑和水置于分液漏斗中充分振蕩，分層后，將水層放入小燒杯內，置于層析缸中平衡一段時間，使濾紙吸飽蒸汽，然后移去小燒杯，將溶劑倒入溶劑槽中，立即將點好樣的濾紙的一端浸入溶劑槽內展層。展開方式可分為上行法、下行法和環(huán)行法及雙向展開法等。目前十六頁\總數九十六頁\編于八點4.展開B.展開方法（上行法）將點有試樣的濾紙條的下端浸入溶劑（但不能浸沒點樣處）上端固定在層析缸的上部，保持垂直，將缸密閉，使溶劑沿下端上升而展層。待溶液上升到距離紙上端3~4cm時，將濾紙取出，用鉛筆在溶劑前沿處畫線作記號（見右圖）目前十七頁\總數九十六頁\編于八點4.展開B.展開方法（下行法）

溶劑自紙的上端向下降（借助于重力的作用），具有分離速度快及連續(xù)揮發(fā)色譜的優(yōu)點。玻皿玻片玻璃棒原點剪成鋸齒狀，便于溶劑滴下目前十八頁\總數九十六頁\編于八點4.展開B.展開方法（環(huán)行法）取一張圓形濾紙在直徑的兩邊各畫兩根平行線，用剪刀沿這兩根線剪至圓心處，在紙的中央滴上試液，干后，將濾紙夾在兩個大小相同培養(yǎng)皿之間，使剪開的紙條的尾端浸入流動相。目前十九頁\總數九十六頁\編于八點4.展開B.展開方法（雙向展開法）

有時用一種溶劑不能將樣品中組份分開時，可以試用雙向展開法。該法是用正方形或長方形濾紙，在紙的一角上點樣，先用一種展開劑朝一個方向展開，展開完畢，待溶劑揮發(fā)后，再用另一種展開劑朝與原來垂直的方向進行第二次展層。目前二十頁\總數九十六頁\編于八點4.顯色a.有色物：直接觀察各個色斑無色物：物理法顯色：用紫外燈照，觀察有無吸收或發(fā)出各種不同顏色的熒光斑點，并用鉛筆畫下斑點的位置及大小。化學法顯色：利用各種物質的特性反應，噴灑適當的顯色劑。如若被分離的物質含有氨基酸，則可噴茚三酮，多數氨基酸呈紫色，個別氨基酸呈黃色。其它化合物所用顯色劑可從手冊里查閱。目前二十一頁\總數九十六頁\編于八點四、應用例１．氨基酸的分離（固定相為水）流動相分離情況正丁醇：2mol/LHAc=1:1酪氨酸、二碘酪氨酸用水飽和的芐醇亮氨酸、異亮氨酸叔丁醇：甲乙酮：甲酸：水＝16:16:0.1:3.9亮氨酸、異亮氨酸目前二十二頁\總數九十六頁\編于八點四、應用例2.糖的分離(固定相為水)流動相分離情況醋酸乙脂:吡啶:水=2:1:1木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖丁醇:吡啶:水=45:25:40乳糖、半乳糖、葡萄糖丁醇:乙醇:水:NH3=40:10:49:1尿中葡萄糖丁醇:乙醇:水=10:1:2蜜二糖、果糖、葡萄糖、目前二十三頁\總數九十六頁\編于八點四、應用例３．脂肪酸的分離（固定相為水）流動相分離情況95%乙醇：濃氨水＝100:1同系的直鏈脂肪酸正己醇：1.5mol/L氨水＝1:1烷氧基酸流動相1:乙醇：濃氨水:H2O=80:5:15流動相2：乙二醇乙醚：桉樹腦：88%甲酸=5:5:2草酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、羥基醋酸、順丁烯二酸、丙二酸、乳酸、琥珀酸、烏頭酸、己二酸、延胡索酸、葵二酸目前二十四頁\總數九十六頁\編于八點四、應用例4.醇、酚的分離（固定相為水）流動相分離情況丁醇：5%NaHCO3＝1:1甲醇、乙醇、異丙醇、異丁醇、異戊醇、辛醇己烷飽和甲醇乙醇、異丙醇、丙醇、異丁醇、正丁醇丁醇：乙醇：水＝4:1.1:1.9乙二醇、丙三醇、甘露糖醇、山梨醇、肌醇目前二十五頁\總數九十六頁\編于八點四、應用流動相分離情況正丁醇：濃氨水：水＝4:1:5磺胺嘧啶、磺胺噻睉、Sulfamerzine、p,p’-sulfonyldianiline正丁醇：醋酸：水＝4:1:5對胺基苯甲酸、維生素C、N－甲基－菸酰胺、菸堿酰胺、菸酸、潘妥寧、泛酸、VB6、VB1甲苯：石油醚：乙醇：水＝200:100:30:70雌酮、雌二酮、雌三酮、馬烯雌酮、脫氫皮質甾酮酸、孕甾酮、順式睪丸甾酮例5.其它類的分離（固定相為水）目前二十六頁\總數九十六頁\編于八點四、應用例6．無機應用（固定相為水）流動相分離情況12mol/LHCl:甲醇:丁醇:甲基異丁酮＝55:35:5:5K+、Rb+

、Cs+乙醇：水＝80:20Li+

、Na+

、K+10%HCl的水飽和丁醇Zn2+－Ga3+－In3+

－Al3+苯酚:甲醇:HCl＝5:3:2Al3+－Ga3+－In3+－Tl3+目前二十七頁\總數九十六頁\編于八點四、應用例7．生物學應用黑毛紅毛黃毛白毛

取不同顏色兔毛(300~500mg),干法灰化,溶于稀HCl中,用丙酮:丁醇:HCl=10:4:2,展開后,顯色目前二十八頁\總數九十六頁\編于八點Exercise1用紙色譜分離混合物中物質A和B，已知兩者的比移值分別為0.50和0.60，問欲使層析后斑點顯著分開，斑點間至少間隔1cm，問濾紙應截取多長？

設前沿為l，原點到A、B斑點中心距離分別為a、b，兩斑點間至少間隔1cm，那么兩斑點中心相距為2.0cm，則可列出：解：原點應距濾紙下端4cm，前沿應距濾紙上端2-3cm，應截取濾紙長20+4+2=26cm,濾紙條應截取26-27cm長。目前二十九頁\總數九十六頁\編于八點Exercise2紙色譜法分離混合離子,若混合離子極性大小順序為A>B>C,用弱極性有機溶劑展開后其Rf值大小順序為______________________。

C,B,A目前三十頁\總數九十六頁\編于八點§5－2薄層色譜法（TLC）一、基本原理和特點二、吸附劑三、操作技術四、應用目前三十一頁\總數九十六頁\編于八點一、基本原理和特點[原理]:經典的薄層色譜是以吸附劑為固定相的一種液相色譜法，利用試樣組分在流動相（展開劑）和固定相（吸附劑）之間反復吸附、溶解而分離。

實際上，薄層色譜的固定相不僅僅局限于吸附劑，也可以在鋪好的惰性薄層上均勻地再涂一種作為固定液的液體，進行分配分離。目前三十二頁\總數九十六頁\編于八點一、基本原理和特點[特點]:

裝置簡單、操作方便展開時間短（10～60min）靈敏度高：可以檢出0.01μg

顯色方法多于紙色譜[缺點］：Rf值的重復性差定性分析：Rf定量分析：光度法或熒光法目前三十三頁\總數九十六頁\編于八點二、吸附劑［要求］：合適的吸附力與展開劑、被吸附物質均不起化學反應粒度細小而且均勻

常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠。此外，硅藻土、硅酸鹽、雜多酸鹽、聚酰胺、纖維素也可用作吸附劑。根據范氏方程，減少渦流擴散項目前三十四頁\總數九十六頁\編于八點1.氧化鋁

氧化鋁可分為中性、堿性和酸性三種，一般常用堿性氧化鋁。通常用于分離碳氫化合物、生物堿類和對堿性物質比較穩(wěn)定的中性和堿性物質。酸性化合物可用酸性氧化鋁分離。

氧化鋁的活性與含水量密切相關（含一定量的水份時，吸附劑表面的吸附中心會被水分子占據）目前三十五頁\總數九十六頁\編于八點1.氧化鋁活性Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Ⅳ

Ⅴ含水量(％)０３６１０１５Δ100~150oC,除去Al2O3中與羥基結合的部分水份，使Al2O3有一定的活性Δ150~300oC，

Al2O3活性達Ⅱ～Ⅲ級Δ300~400oC，Al2O3活性達Ⅰ

～Ⅱ級Δ>600oC，Al2O3進一步脫水并開始燒結一般要求薄板用的活性為Ⅱ~Ⅲ級目前三十六頁\總數九十六頁\編于八點

由于脫水過程受到許多因素的影響，因此，每批生產的Al2O3

，其表面積和表面孔穴結構并不一致，活性也不相同。

Al2O3活性的測定：取20μL染料溶液（偶氮苯30mg、對－甲氧基偶氮苯、蘇丹黃、蘇丹紅、和對氨基偶氮苯各20mg，溶解于50mLCCl4中），加到薄板上，用CCl4展層，根據下表確定活性。目前三十七頁\總數九十六頁\編于八點活性ⅡⅢⅣⅤRf,偶氮苯0.590.740.850.95Rf,對-甲氧基偶氮苯0.160.490.690.89Rf,蘇丹黃0.010.250.570.78Rf,蘇丹紅0.000.100.330.56Rf,偶氮苯0.000.030.080.19Al2O3活性表目前三十八頁\總數九十六頁\編于八點市售的供薄層色譜用的Al2O3有:Al2O3

－H氧化鋁中無粘合劑Al2O3

－G氧化鋁中含煅石膏（一般5％煅石膏）［煅石膏CaSO4，作為粘合劑］Al2O3

－HF254氧化鋁中不含煅石膏，僅含熒光指示劑（在254nm下呈黃綠色熒光）Al2O3

－GF254氧化鋁中既含煅石膏又含熒光指示劑（在254nm下呈黃綠色熒光）上述商品可以直接調料涂敷（1份料，2份水調合）目前三十九頁\總數九十六頁\編于八點2.硅膠

硅膠是微酸性吸附劑，適用于酸性、中性物質的分離（如有機酸、氨基酸、萜類、甾類），堿性物質則能與硅膠作用（當用中性溶劑展層，堿性物質有時停留在原點不動，或者得到拖尾的斑點，而不能很好的分離）活性ⅠⅡ

ⅢⅣⅤ含水量（％）05152535注硅膠薄層的活化溫度不能高于200oC目前四十頁\總數九十六頁\編于八點

硅膠活性的測定：稱取二甲黃、蘇丹紅、靛酚藍各40mg溶于100mL苯中，將此混合液滴加于薄層上，用石油醚展開10cm，混合物應不動；如用苯展開，則應分成三個斑點，其Rf值分別為：二甲黃0.58，蘇丹紅0.19，靛酚藍0.08（展層時間30~45min），則認為此硅膠合格。經本法測定的活性與Al2O3活性Ⅱ~Ⅲ級相當。

薄層用商品硅膠有：硅膠H（不含粘結劑）、硅膠G（含粘結劑煅石膏）、硅膠HF254（含熒光物質的硅膠）硅膠GF254（含有煅石膏和熒光劑）目前四十一頁\總數九十六頁\編于八點3.吸附劑的選擇1）根據樣品組分的性質親脂性選擇硅膠、氧化鋁、乙酰化纖維素、聚酰胺等親水性選擇離子交換纖維素、硅藻土等酸性物質首選硅膠板，堿性物質首選氧化鋁板極性很大的物質解吸難時可用聚酰胺（如酚）2）根據吸附劑的性質適宜活性：活性大，易脫尾；活性小，不能分離考慮吸附劑對樣品的作用：如堿性氧化鋁對酯的水解起催化作用。目前四十二頁\總數九十六頁\編于八點三、操作技術1.薄層板的制備2.樣品溶液的配制3.點樣4.展開5.顯色6.定性定量分析7.常見問題及消除方法目前四十三頁\總數九十六頁\編于八點1.薄層板的制備

玻璃板

a.平整、去油、去污（可用濃H2SO4-K2CrO7洗液浸洗，或丙酮擦洗，自來水洗凈后，烘干）

b.玻璃板的尺寸根據自己的需要自由選擇，小的可用2.57.5cm的載玻片,大的可用2020cm的玻片。

涂鋪液

取一定量的吸附劑放入研缽中，加入需要的水或適當的溶劑，研磨時間以調成稀糊狀為度，當濃度均一后，即成膠狀物，色澤潔白為最佳，立即傾入玻璃板上，用下述方法涂布。目前四十四頁\總數九十六頁\編于八點1.薄層板的制備

涂布方法

軟板的制備：干法鋪層。

硬板的制備：濕法鋪板。方法有傾注法，平鋪法和涂鋪器法三種。目前廣為應用的是涂鋪器法，操作簡便，薄板厚度均勻，適合于定量分析。目前四十五頁\總數九十六頁\編于八點1.薄層板的制備

活化

薄板首先風干，否則濕板一下加熱到高溫，烘出的薄板很酥松，使用效果不好。

氧化鋁G板在150~160oC,烘4小時(Ⅱ級左右)

硅膠G板在110oC烘1小時薄板經活化后，一定要儲藏在密閉的干燥器或烘箱中備用。目前四十六頁\總數九十六頁\編于八點2.樣品溶液的制備

首先將固體樣品粉碎過篩：疏松的粉末過40目篩，堅實的粉末過80目篩

用適宜的方法和溶劑提取樣品組分：其提取方法包括索式提取器提取法、冷浸法、熱回流法、振搖提取法、超聲提取法。

樣品溶液的精制（除去雜質）：溶劑萃取或柱色譜法

溶液的蒸發(fā)與殘渣的溶解（對溶液濃縮）：（常用旋轉蒸發(fā)儀、KD濃縮器、水浴蒸發(fā)等）目前四十七頁\總數九十六頁\編于八點旋轉蒸發(fā)儀KD濃縮器目前四十八頁\總數九十六頁\編于八點3.點樣

點樣方法類似于紙色譜

點樣量一般1~10μL。點樣器有微量注射器，容量毛細管和精密的自動或半自動點樣儀點樣的形狀一般為圓點，直徑小于3mm切勿損傷薄層表面目前四十九頁\總數九十六頁\編于八點4.展開1）對展開劑的要求※

能夠溶解待測組分※

能使待測組分與雜質分開※

使待測組分的Rf值在0.2~0.8之間，定量測定最好在0.3~0.5之間?！?/p>

不能與待測組分或吸附劑發(fā)生化學反應※

具有適中的沸點和比較小的粘度※

混合溶劑最好臨用前新鮮配制。目前五十頁\總數九十六頁\編于八點2）展開劑的性質A極性：單一溶劑的極性順序是：石油醚<環(huán)己烷<二硫化碳<苯<四氯化碳<三氯乙烯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<水

混合溶劑的極性參數P’=δAPA＋δBPB（δA是體積分數）B強度在吸附色譜中，用εo表示，指溶劑在單位表面積的標定活性的吸附劑上的吸附能。分配色譜與極性參數有關。目前五十一頁\總數九十六頁\編于八點C展開劑的選擇性組別溶劑名稱Ⅰ脂肪族醚，三級烷胺，四甲基胍，六甲基磷酰胺Ⅱ脂肪醇Ⅲ吡啶，四氫呋喃，酰胺（除甲酰胺），乙二醇醚，亞砜Ⅳ乙二醇，苯甲醇，甲酰胺，乙酸Ⅴ二氯甲烷，二氯乙烷Ⅵa磷酸三甲苯酯，脂肪族酮和酯，聚醚，二氧六環(huán)Ⅵb腈，砜，碳酸丙烯酯Ⅶ硝基化合物，芳香醚，芳烴，鹵代芳烴Ⅷ氟烷醇，間甲苯酚，氯仿，水

根據溶劑分子與樣品分子間的四種作用力，將溶劑分為八組。目前五十二頁\總數九十六頁\編于八點3）展開劑的選擇A總原則：

先用一展開劑，它的極性或強度能夠使容量因子k最好在0.5~5之間（或Rf值在0.2~0.6)，然后保持此強度不變，然后根據溶劑的選擇性再更換其他的展開劑，直到使待測組分很好分離。B二元展開劑的選擇由一個強度較強的溶劑和一個強度近于零的溶劑（強度調節(jié)劑）混合并計算其強度。正相TLC多用正己烷為強度調節(jié)劑，反相TLC則使用水。目前五十三頁\總數九十六頁\編于八點3）展開劑的選擇C多元展開劑的選擇Glajch提出了確定溶劑強度和選擇性的最優(yōu)化三角形法.

做法如下：先選三種選擇性相差大的純溶劑，再選一種調節(jié)極性的純溶劑組成三個相等洗脫強度的二元基本溶劑A,B,C.BACDEFGHIJ

然后再分別配成A:B:C=0.5:0.5:0,(D)0.5:0:0.5(E),0:0.5:0.5(F)和0.33:0.33:0.33(G),0.67:0.16:0.16(H)0.16:0.16:0.67(I),0.16:0.67:0.16(J)的幾種混合溶劑。目前五十四頁\總數九十六頁\編于八點以正相TLC法為例：1）先選擇溶劑選擇性相差較大的三種溶劑：乙醚(Ⅰ)、氯仿(Ⅷ)和二氯甲烷(Ⅴ)。選正己烷為極性調節(jié)劑。2)用氯仿-正己烷的不同比例在硅膠板上分離樣品，發(fā)現用氯仿：正己烷＝34：66的組成比例可使斑點(待測組分)的Rf在0.3~0.5之間，算出極性參數：P’=4.1×0.34+0.1×0.66=1.46。保持P’不變，計算出其他兩個二元溶劑的體積比。二氯甲烷：正己烷＝45：55，乙醚：正己烷＝50：50。3)再根據Glajch三角形圖，確定其他七種多元體系的體積比。目前五十五頁\總數九十六頁\編于八點4）展開方式TLC的展開方式類似于紙色譜。矮型色譜缸內一般用近水平上行展開，不加粘合劑的板層也適合在此展開；直立上行一般在長方筒形或雙底槽色譜缸中進行，這種展開只適合含有粘合劑的薄層。目前五十六頁\總數九十六頁\編于八點5.顯色1）光學檢出法本身是有色物，可以直接觀測斑點的位置和顏色本身無色但在紫外線的照射下會發(fā)出不同顏色的熒光在可見光和紫外光下都不顯示，也沒有合適的顯色方法，可以用熒光薄板(硅膠HF254+366,硅膠GF254,...)進行分離,欲測物吸收紫外線,在熒光背景下呈暗色目前五十七頁\總數九十六頁\編于八點5.顯色3）生物自顯影

對于抗菌素等具有生物活性的物質，將分離后的薄層與具有適當微生物的瓊脂培養(yǎng)基表面接觸，經過培養(yǎng)后觀察抑菌點。4）放射自顯影

在薄層上分離的放射性同位素的輻射線，可使照相底片感光，照片所呈暗度與斑點的放射活性成正比，因此，得到的放射顯跡圖可以定性和定量。2)蒸氣顯色法利用一些物質的蒸氣與樣品作用生成不同顏色或產生熒光。如多數有機物吸附碘蒸氣顯示黃色斑點。目前五十八頁\總數九十六頁\編于八點5.顯色5）試劑顯色法

薄層色譜中顯色最多的方法是光學檢出法和試劑顯色法

展開后的薄層根據待測化合物的性質選擇適當的顯色劑使之生成顏色穩(wěn)定、輪廓清晰、靈敏度高的色斑。由于對薄層板的處理方式不同，試劑顯色法又分為噴霧顯色和浸漬顯色兩種。不加粘合劑的薄板禁用

有些顯色反應需要加熱，一般在恒溫烤箱內進行，溫度控制在100~110℃。目前五十九頁\總數九十六頁\編于八點表主要顯色試劑試劑配制及使用方法檢出范圍濃H2SO4噴霧,100~120oC,觀察顏色變化高級醇、醛、酮、甾體H2SO4-K2Cr2O75gK2Cr2O7+100mLH2SO4,噴霧,280oC觀察顏色變化全部有機物2’,7’-二氯熒光黃(0.2%乙醇)噴霧，紫外線照射類脂類化合物I2-KI1gI2+10gKI溶于50mLH2O中，加入2mLHAc，稀釋至100mL，噴霧生物堿目前六十頁\總數九十六頁\編于八點試劑配制及使用方法檢出范圍溴甲酚綠0.04g溶于100mL乙醇中，以0.1mol/LNaOH調至藍色剛消失，<pH3.6顯黃色羧基酸Ag(NH3)2+2.6gAgNO3溶于50mL水，加入NH3H2O至沉淀剛好消失還原性物質、醛、還原糖茚三酮0.5%丙酮溶液胺類（如麻黃堿、氨基酸等）FeCl31g溶于100mL酚羥基、鞣質、黃酮磷鉬酸5g溶于100mL95%乙醇脂肪、甾類、類脂、三萜酸、生物堿續(xù)表主要顯色試劑目前六十一頁\總數九十六頁\編于八點6.定性定量分析1）定性分析

比移值定性：標準物質對照。

光譜定性：薄層掃描儀

各種聯用檢測儀器聯用：將斑點吸附轉移到試管中，用其他方法純化，然后進行紫外、熒光、紅外等光譜法定性。目前六十二頁\總數九十六頁\編于八點6.定性定量分析2）定量分析

目視比較半定量法：雜質的限量實驗。測量斑點面積：要求斑點邊緣清晰從薄層上將被測組分洗脫下來進行定量測定：先確定斑點，再取下斑點和吸附劑，最后用適當的洗脫劑洗脫分析物，進行測定薄層色譜掃描儀原位定量測定：紫外－可見吸收測定或熒光測定法。目前六十三頁\總數九十六頁\編于八點7.常見問題及消除辦法1）斑點拖尾現象▲酸性物質用中性溶劑展開時，造成拖尾。（在展開劑中加入一定濃度的酸）。堿性物質類似?！趬A性氧化鋁薄層上分離酸性物質，或在硅膠G板上分離生物堿，由于成鹽而造成拖尾。（禁止此類操作）▲點樣量過多造成拖尾（減少點樣量）目前六十四頁\總數九十六頁\編于八點7.常見問題及消除辦法3）邊緣效應

板層中部斑點的Rf值小于兩側斑點的Rf值，這是因為沸點較低的和與吸附劑親和力弱的溶劑在薄層的兩個邊緣處較易揮發(fā)（用刀片刮去同樣寬度的邊或增加板層的預飽和時間）2）S形及波浪形斑點

主要由于吸附劑的顆粒細度和板層厚度不均勻造成（鋪板時要注意這個問題）目前六十五頁\總數九十六頁\編于八點7.常見問題及消除辦法5）Rf值不穩(wěn)定

溫度、分配系數、展開劑的揮發(fā)、板層厚度和不同批號的薄層板都影響Rf值。注意逐一分析。4）展速慢

加入丙酮等中等極性溶劑可使不相混合的溶劑混合，加快展速。目前六十六頁\總數九十六頁\編于八點四、應用1.氨基酸分離薄層:硅膠G板;流動相:

正丁醇:醋酸:水=3:1:1Rf值:丙氨酸0.27,氨基辛酸0.60,精氨酸鹽酸鹽0.08,磺基丙氨酸0.14,胱氨酸鹽酸鹽0.16,二羥基苯丙氨酸0.45,

甘氨酸0.22,組氨酸鹽酸鹽0.06,羥脯氨酸0.20,亮氨酸0.47,甲硫氨酸0.40,頡氨酸0.36,

苯丙氨酸0.49,脯氨酸0.19,肌氨酸0.17,蘇氨酸0.25,色氨酸0.56目前六十七頁\總數九十六頁\編于八點2.核苷,核苷酸,寡核苷酸的分離薄層:硅膠F254

流動相:正丁醇:HAc:H2O=5:2:3Rf值:腺苷-5`-磷酸0.35,胞苷-5`-磷酸0.24,脫氧腺苷-5`-磷酸三氯乙酯0.74,脫氧胸苷酰(3`,5`)脫氧胸腺嘧啶核苷0.61,5-甲基尿苷-5`-磷酸酯(胸苷-5`-磷酸)0.37,5`-0-磷酸基脫氧胸腺嘧啶核苷酰-(3`5`)脫氧胸腺苷酰-(3,5)脫氧胸苷0.19,5`-0-三氯乙基-磷酸脫氧腺苷酰(3`,5)脫氧腺苷0.68,尿苷-5`-磷酸0.30四、應用目前六十八頁\總數九十六頁\編于八點3.類固醇、固醇的分離薄層：Al2O3

流動相：C6H6:乙酸乙酯=4:1Rf值:膽甾醇0.83,別色膽甾醇0.77,-谷甾醇0.63,豆甾醇0.62,-谷甾烷醇0.444.堿金屬的分離薄層:硅膠卷流動相：含0.1mol/LI2

的硝基甲烷:C6H6=40:60Rf值:Cs+0.55,Rb+0.47,K+0.36,NH4+0.24,Na+0.18,Li+0.06四、應用目前六十九頁\總數九十六頁\編于八點§5－3凝膠色譜法一、基本原理和特點二、凝膠的種類和性質三、操作技術四、應用目前七十頁\總數九十六頁\編于八點一、基本原理和特點

1.原理：按溶質分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。所以凝膠色譜又稱為排阻色譜。它的分離機理與其他色譜完全不同，它不是依靠溶質在兩相間的作用力不同而分離的。

目前七十一頁\總數九十六頁\編于八點2.特點：◎全部在死體積前出峰。所以保留時間短，柱內峰擴展就比其他分離方法小很多，所以峰通常比較窄，有利于檢測。

◎分離對象范圍寬。可對相對分子質量在100-105范圍內的化合物按質量分離

◎

固定相和流動相選擇方便，根據流動相不同，分為兩類：以水溶液作流動相的叫做凝膠過濾色譜，分離溶于水的物質；以有機溶劑為流動相的叫做凝膠滲透色譜，分離不溶于水的物質?！?/p>

只能分離相對分子質量相差10％以上的分子，不能分離分子量接近、分子大小相似的分子。一、基本原理和特點目前七十二頁\總數九十六頁\編于八點二、凝膠的種類和性質

1.凝膠的種類所謂凝膠，是含有大量液體（一般是水）的柔軟而富有彈性的物質，是一種經過交聯而具有立體網狀結構的多聚體。

?根據凝膠的來源分類，凝膠可分為無機凝膠和有機凝膠兩類。

?根據凝膠的制備方法可分為均勻凝膠、半均勻凝膠和非均勻凝膠。

?根據凝膠使用的強度可分為軟質凝膠、半硬質凝膠、硬質凝膠。

?根據凝膠對溶劑的適用范圍，凝膠可分為親水性、親油性和兩性凝膠。目前七十三頁\總數九十六頁\編于八點二、凝膠的種類和性質①多孔硅膠

是使用較多的無機凝膠，它的特點是穩(wěn)定性好、機械強度好，可在柱中直接更換溶劑。缺點是吸附問題，需要經特殊處理。一般表面未處理硅膠可用于水、酸體系，但不能用于強堿性溶劑；表面硅烷化的硅膠可用于有機溶劑。由于多孔硅膠的機械強度高，因此在交聯聚苯乙烯凝膠后，細粒度的多孔硅膠已經發(fā)展成為一種很好的高速、高效凝膠色譜填料。其中以μBondagel更有特色，能成功分離水中的生化體系。目前七十四頁\總數九十六頁\編于八點二、凝膠的種類和性質②

交聯聚苯乙烯凝膠

商品名叫Styrogel，這種凝膠孔徑分布比較寬，因此分子量分離范圍比較大，可分離分子量從1600到40000000的生物大分子。主要使用非極性溶劑，丙酮、乙醇等極性溶劑不能應用，且不能在柱中直接更換溶劑。最高使用溫度為150℃，一般裝完柱后不再拆下來。洗脫劑可用甲基亞砜。適用于有機多聚物、分子量測定和脂溶性天然物的分離。目前七十五頁\總數九十六頁\編于八點二、凝膠的種類和性質③交聯葡聚糖凝膠

商品名叫Sephadex，是最早發(fā)展的有機凝膠。主要有sephadexG型和SephadexLH－20型。

SephadexG型的凝膠在字母G后面用阿拉伯數字表示得水值的10倍。如G－25表示每克凝膠膨脹時吸水2.5克。目前主要有G－10，15，25，50，75，100，150，200等型。主要應用于生物高分子如蛋白質、核酸、酶以及多糖類的分離，生化體系的脫鹽等。

SephadexLH－20型是sephadexG－25的羧丙基衍生物，屬于兩性凝膠，可用于分離不溶于水的物質。目前七十六頁\總數九十六頁\編于八點二、凝膠的種類和性質④交聯聚丙烯酰胺凝膠

是丙烯酰胺和次甲基雙丙烯酰胺的共聚物，其商品名為Bio-GelP，型號有P－2,4,6,10,30,60,100,150,200，300等10種。P后面的數字乘以1000就是凝膠的排阻限度。這類凝膠的優(yōu)點是孔徑尺寸范圍較寬，所以分離范圍大。如Bio－GelP－300分離分子的分子量范圍可從60000～400000。骨架沒有離子基團，因而吸附效應小。不溶于水、鹽溶液和普通有機溶劑。其最大弱點是不耐酸，遇酸時酰胺鍵易水解產生羧基，帶上一定量的離子交換基團，一般在pH2～11范圍內比較穩(wěn)定。目前七十七頁\總數九十六頁\編于八點二、凝膠的種類和性質⑤瓊脂糖凝膠

是全天然凝膠，商品名較多。如Sepharose（瑞典pharmacia），Bio－Gel－A（美國Bio－Rad）等。它是瓊脂經過分級沉淀除去了帶電荷的瓊脂膠，留下了不帶電荷的瓊脂糖的產品，然后在油相中分散成球。它是用來分離高分子量物質的凝膠，滲透極限極高，分離范圍的下限相當于前兩種凝膠的上限。因而瓊脂糖凝膠使得分離一些分子量極高的物質如病毒成為可能。瓊脂糖凝膠在高溫下不穩(wěn)定，在40℃以上就開始熔解。要避免如脲素溶液等破壞氫鍵結構的淋洗劑。要用化學滅菌的方式殺菌，避免堵塞柱子。目前七十八頁\總數九十六頁\編于八點二、凝膠的種類和性質

2.凝膠的性質凝膠的性質分為凝膠的結構參數和色譜指標兩類。凝膠的結構參數一般有粒度、比表面積、孔體積、堆比重（指緊密堆積每毫升凝膠的重量）、骨架密度、孔度（孔的體積占多孔性物質總體積的分數）、平均孔徑和孔徑分布等。凝膠的色譜指標主要有滲透極限、分離范圍、固流相比和柱效四個。目前七十九頁\總數九十六頁\編于八點二、凝膠的種類和性質①滲透極限

指凝膠可以用來分離高分子的最大極限。超過這個極限，高分子都在凝膠粒間隙體積V0處流出，沒有分離效果。②分離范圍

一般是指分子量－淋出體積標定曲線的線性部分。孔徑分布寬的凝膠分離范圍大。實際應用時可以用不同規(guī)格的凝膠串聯起來。目前八十頁\總數九十六頁\編于八點二、凝膠的種類和性質③固流相比

指固定相的體積（指色譜柱內凝膠的全部可滲透的孔內體積）比上流動相的體積（凝膠的粒間隙體積），它反映了色譜柱的分離容量。分離容量越大越好。④柱效是凝膠分離效率的量度?？捎脤嶒灧椒y定，讓一個小分子試樣流經長度L的柱子，得到色譜峰（Ve是淋出體積，W是峰寬），則單位柱長的柱效為：目前八十一頁\總數九十六頁\編于八點三、操作技術1.層析柱的選擇

層析柱是凝膠分離的主體，一般使用玻璃管或有機玻璃管。層析柱的直徑不影響分離度，樣品用量大可選擇直徑大的柱。分離度與柱長的平方根成正比，但由于軟質凝膠柱過高易造成擠壓變形從而堵塞柱子，所以一般不超過1m。分族分離柱長一般20～30cm，柱高與柱直徑之比一般在5：1～10：1之間，而分級分離柱長一般為50～100cm，柱高與柱直徑之比一般在20：1～100：1之間。目前八十二頁\總數九十六頁\編于八點三、操作技術2.凝膠的選擇

凝膠的選擇主要考慮兩點：Ⅰ）凝膠和溶劑的匹配Ⅱ）凝膠的孔徑及其分布與被測試樣分子體積范圍的匹配。由于目前凝膠種類繁多，所以選擇和流動相相匹配的凝膠并不難，只要求能被流動相溶解即可，而對于凝膠的孔徑和分布的選擇，一般需作標定曲線，找出凝膠的選擇性滲透的范圍，再根據分子的體積范圍進行選擇。目前八十三頁\總數九十六頁\編于八點三、操作技術3.凝膠的制備

商品凝膠是干燥的顆粒，使用前需要在欲分離的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法。即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫，這樣可以大大加速膨脹，通常在1～2h之內即可完成。特別在使用軟凝膠時，自然膨脹需24h甚至數天，而加熱法在幾小時內即可完成。而且使用加熱法還可消毒，并除去凝膠中污染的細菌和空氣。目前八十四頁\總數九十六頁\編于八點三、操作技術4.裝柱

裝柱的基本原則是：色譜柱應填得盡可能均勻和緊密，在柱中沒有裂縫或溝槽，也不發(fā)生柱的徑向或軸向凝膠的不均勻分布。色譜柱的裝填可以分為干法和漿法裝柱兩種。粒度較大的硬膠和多孔硅膠及多孔玻璃可以用干法裝柱；漿法裝柱首先需要尋找與凝膠密度相同的混合溶劑，這樣才不會發(fā)生粒度分層。目前八十五頁\總數九十六頁\編于八點三、操作技術5.溶劑的選擇

①溶劑應與凝膠色譜儀匹配：首先考慮色譜儀材料能否忍受的問題，如腐蝕不銹鋼的溶劑不能選。另外，溶劑還應與檢測器匹配，如使用示差折光檢測器，那么溶劑的折光指數應與被測試樣的折光指數有盡可能大的差別。

②盡可能使用純