蛋白質(zhì)的分離純化及雙向電泳演示文稿

蛋白質(zhì)的分離純化及雙向電泳演示文稿目前一頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)優(yōu)選蛋白質(zhì)的分離純化及雙向電泳目前二頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)的兩性離解和電泳現(xiàn)象蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的沉淀作用蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的紫外吸收一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)目前三頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)(IsoelectricpointpI)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動(dòng)。在不同的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。在等電點(diǎn)偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)；在等電點(diǎn)偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動(dòng)。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳(Electrophoresis)。1蛋白質(zhì)的兩性離解和電泳現(xiàn)象目前四頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)電泳蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。目前五頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運(yùn)動(dòng)等。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。2蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)目前六頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來。3蛋白質(zhì)的沉淀作用目前七頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。3蛋白質(zhì)的沉淀作用可逆沉淀目前八頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。3蛋白質(zhì)的沉淀作用不可逆沉淀目前九頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。某些物理或化學(xué)因素，能夠破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性(denaturation)。4蛋白質(zhì)的變性目前十頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)的變性變性蛋白質(zhì)通常都是固體狀態(tài)物質(zhì)，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復(fù)原有蛋白質(zhì)所具有的性質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強(qiáng)酸和強(qiáng)堿等。目前十一頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm附近顯示強(qiáng)的吸收。利用這個(gè)性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定。5蛋白質(zhì)的紫外吸收目前十二頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)二、蛋白質(zhì)分離和純化研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，首先需要得到純的蛋白質(zhì)樣品。(1)蛋白質(zhì)來源：微生物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞；(2)隨時(shí)測定蛋白質(zhì)活性并檢測蛋白質(zhì)含量。(3)分離和純化過程都必須在溫和的條件下進(jìn)行。目前十三頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)1．蛋白質(zhì)的分離步驟(1)生物組織的機(jī)械破碎。常用的方法有研磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等。(2)根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進(jìn)行抽提。水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提，酸性蛋白用稀堿性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等。(3)粗提:離心除去固體雜質(zhì)后，可通過沉淀法、超濾法、萃取法等處理，得到蛋白質(zhì)粗制品。(4)精制：可用層析法、電泳法等進(jìn)行精制。(5)成品加工：測定蛋白質(zhì)的性質(zhì)并干燥成成品。目前十四頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法根據(jù)蛋白質(zhì)的親水膠體性質(zhì)，當(dāng)其環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生沉淀作用(Precipitation)。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子量大小不同、表面所代電荷不同、表面的親水和疏水區(qū)域不同，所以可以通過可逆沉淀法將蛋白質(zhì)分離出來。沉淀法具有部分純化、濃縮特點(diǎn)。(1)沉淀法目前十五頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)沉淀法膜分離法萃取法層析法電泳法2．蛋白質(zhì)的純化方法目前十六頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)在高濃度的中性鹽溶液中，由于水化層被破壞和表面電荷被中和，容易發(fā)生沉淀陰離子化合物的效果是：NH4+>K+>Na+陽離子化合物的效果是：PO43->SO42->Cl-常用的鹽為硫酸銨。不同的蛋白質(zhì)由于所帶的電荷和水化程度不同，鹽析時(shí)所需的鹽的濃度也不相同，因而可以將不同的蛋白質(zhì)加以分離。(1)沉淀法鹽析目前十七頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法在蛋白質(zhì)溶液中，加入一定量的與水互溶的有機(jī)溶劑，由于這些溶劑與水的親和力強(qiáng)，能夠破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而沉淀。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、甲醇和丙酮等。為了防止蛋白質(zhì)在分離過程中發(fā)生變性，有機(jī)溶劑濃度不能太高(30%-50%)，而且需要在低溫條件下進(jìn)行。(1)沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法目前十八頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)分子在等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物溶液的pH被調(diào)到某一成分的等電點(diǎn)時(shí)，則該蛋白質(zhì)大部或全部將沉淀出來。而那些等電點(diǎn)高于或低于該pH的蛋白質(zhì)仍然留在溶液中。該法適用于在等電點(diǎn)pH穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。(1)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法目前十九頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法Dialysis此法是利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜，而使它與其它小分子化合物，如無機(jī)鹽、單糖、雙糖、氨基酸、小肽以及表面活性劑等分離。常用的半透膜有玻璃紙或高分子合成材料，截止分子量一般為一萬。（2）膜分離法透析法目前二十頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法透析是將待純化的蛋白質(zhì)溶液裝在用半透膜制成的透析袋內(nèi)，再將透析袋放入透析液（通常是蒸餾水或緩沖液）中進(jìn)行透析。通透動(dòng)力為半透膜兩側(cè)的物質(zhì)濃度差。（2）膜分離法透析法目前二十一頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法超過濾技術(shù)是在一定的密封容器，施加一定壓力使一定分子量的物質(zhì)透過超濾膜。其中包括有：中空纖維超濾器、圓筒式超濾器、板式超濾器。超濾膜的截止分子量有100萬、50萬、30萬、10萬、5萬、1萬、5千和1千（2）膜分離法超過濾法目前二十二頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法超過濾法目前二十三頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法兩種親水性高分子或一種高分子聚合物與一種鹽溶液混合后，因疏水性差異而分層。不同的蛋白質(zhì)在疏水層的溶解能力不同而被萃取。目前主要采用兩種體系聚乙二醇－葡聚糖聚乙二醇－磷酸鉀（3）萃取法雙水相萃取法目前二十四頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法由于蛋白質(zhì)表面電荷性質(zhì)、疏水性質(zhì)不同，用有機(jī)溶劑、表面活性劑、水構(gòu)成的反相膠束提取某些蛋白質(zhì)。將表面活性劑溶解于有機(jī)溶劑中，等體積加入到蛋白質(zhì)水溶液內(nèi)，混合后可使某些蛋白質(zhì)萃取到反相膠束內(nèi)。（3）萃取法反相膠束萃取法目前二十五頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法最常用的是二氧化碳，在78.3Mpa壓力下，CO2處于液體狀態(tài)，溫度為31.1°C，當(dāng)壓力或溫度發(fā)生改變時(shí)，CO2處于氣－液中間態(tài)，具有溶劑性能，可以使許多蛋白質(zhì)及有機(jī)物質(zhì)溶解在某一狀態(tài)。經(jīng)過泵出、升溫等步驟即可分離出來。（3）萃取法超臨界流體萃取法目前二十六頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法（3）萃取法超臨界流體萃取法目前二十七頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的方法。離子交換樹脂可以分為陽離子交換樹脂（如羧甲基纖維素等），陰離子交換樹脂（如二乙基氨基乙基纖維素等）。帶正電荷多的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合較強(qiáng)，而帶正電荷少的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合則較弱。用不同濃度的陽離子洗脫液，如NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，通過Na+的離子交換作用，可以將帶有不同正電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。（4）層析法離子交換層析法目前二十八頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法（4）層析法離子交換層析法目前二十九頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法此法又稱為分子篩層析。凝膠過濾所用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Sephadex-葡聚糖凝膠G10-G200Sepharose-瓊脂糖凝膠2B,4B,6BSephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝膠S100,S200,S300,S400（4）層析法凝膠過濾法目前三十頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法（4）層析法凝膠過濾法目前三十一頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法利用蛋白質(zhì)表面存在的疏水區(qū)域的強(qiáng)度、大小不同，而被吸附到連接有疏水基團(tuán)的層析介質(zhì)上。離子強(qiáng)度增大可增強(qiáng)吸附能力，因此常常在2mol/L或3mol/LNaCl溶解樣品，洗脫時(shí)可通過降低鹽濃度、增加乙二醇濃度進(jìn)行梯度洗脫。正丁基-Sepharose、正辛基-Sepharose苯基-Sepharose（4）層析法疏水層析目前三十二頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法這是一種高效分離純化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白質(zhì)分子對于固定化在載體上的特殊配基具有不同的識(shí)別和結(jié)合能力。選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識(shí)別和結(jié)合作用的配基，然后應(yīng)用化學(xué)方法將該配基與載體共價(jià)連接。將這種連接有配基的載體裝入層析柱中，當(dāng)含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過層析柱時(shí)，該蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱上，而其它蛋白質(zhì)則流出柱外。被特異性結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)呐潴w洗脫液洗脫。（4）層析法親和層析法目前三十三頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法

常用的配基有抗體、抗原、激素或受體蛋白、酶的底物和抑制劑等。層析柱載體為瓊脂糖凝膠等。（4）層析法親和層析法目前三十四頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法在外電場的作用下，帶電顆粒將向著與其電性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質(zhì)溶液的pH值不等于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒均帶有不同的電荷。由于不同蛋白質(zhì)的分子量不同，所帶的電荷不同，因而在電場中移動(dòng)的速度也不相同。在外加電場作用下，帶電的蛋白質(zhì)顆粒在電場中移動(dòng)的速度（v）取決于電場強(qiáng)度(E)，所帶的凈電荷(q)以及與介質(zhì)的摩擦系數(shù)(f)。（5）電泳法目前三十五頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約12比例結(jié)合。這樣，每一個(gè)蛋白質(zhì)分子都因?yàn)榻Y(jié)合了許多的SDS而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。由于所有的蛋白質(zhì)顆粒都帶有大量的負(fù)電荷，而且它們的電荷密度也大體相同，因此，Eq值接近一個(gè)常數(shù)。所以該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì)。用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。（5）電泳法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法目前三十六頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)2．蛋白質(zhì)的純化方法將兩性電解質(zhì)(pH3-9,或其它范圍的如pH5-7)同蛋白質(zhì)樣品一起加入到已經(jīng)鋪好的凝膠上，在電場下，兩性電解質(zhì)首先達(dá)到它的等電點(diǎn)而平衡，蛋白質(zhì)樣品根據(jù)它自身的等電點(diǎn)分別向兩極移動(dòng)，最后也達(dá)到平衡。（5）電泳法等電聚焦目前三十七頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)3.蛋白質(zhì)含量的測定定氮法：靈敏度較低mg/LFolin-Lowry法：在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反應(yīng)，生成藍(lán)色化合物，將其與雙羧脲法結(jié)合起來，蛋白質(zhì)形成兩種顏色的混合物老綠色，在650nm具有特定的吸收。靈敏度較高25g-250g/ml.目前三十八頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）

考馬斯亮藍(lán)G250是一種帶有負(fù)電荷的染料，在酸性條件下，可與蛋白質(zhì)上的正電荷結(jié)合，形成藍(lán)色化合物，在595nm具有特定吸收，反應(yīng)簡便、快速、靈敏度高，5-50g/ml.紫外吸收法由于核酸在260nm具有光吸收，對測定干擾較大，可采用280nm、260nm同測法。蛋白質(zhì)濃度目前三十九頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)4.蛋白質(zhì)純度等的測定純度和分子量的測定：采用電泳（如聚丙烯酰胺凝膠電泳，梯度凝膠電泳等）、高速離心、分子篩層析、高效液相色譜等技術(shù)測定。等電點(diǎn)的測定：利用等電聚焦方法測定。亞基個(gè)數(shù)的測定：采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳方法測定。目前四十頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)雙向電泳簡介及其在園藝學(xué)中的應(yīng)用目前四十一頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)目前四十二頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)目前四十三頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)目前四十四頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)目前四十五頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)目前四十六頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)目前四十七頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)目前四十八頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)目前四十九頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)生物學(xué)問題的提出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對照組樣品的制備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點(diǎn)的切取胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白信息的初步獲得蛋白質(zhì)組分析流程目前五十頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳圖像分析轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索新的或已知蛋白蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定目前五十一頁\總數(shù)六十