月第4周基因工程

基因工程基因工程的概念基因工程的別名基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過程結(jié)果

基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)生物體外基因DNA分子水平剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)符合人類需要的基因產(chǎn)物基因工程培育抗蟲棉簡(jiǎn)要過程：普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因與運(yùn)載體DNA拼接棉花細(xì)胞(含抗蟲基因)棉花植株(有抗蟲特性)上述培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟是什么？導(dǎo)入重組DNA關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與運(yùn)載體DNA連接關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因?qū)胧荏w(棉花)細(xì)胞

分子手術(shù)刀：核酸限制性內(nèi)切酶（限制酶）

分子縫合針：DNA連接酶

分子運(yùn)輸車：載體識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。1、主要來源：

2、種類和命名：

3、作用：

4、結(jié)果：一、“分子手術(shù)刀”

—限制性核酸內(nèi)切酶形成兩種末端粘性末端平末端原核生物特點(diǎn)：專一性一種限制酶只能識(shí)別一種特定核苷酸序列，并在特定的位點(diǎn)切割

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback識(shí)別序列的特點(diǎn)：中軸線兩側(cè)的堿基反向?qū)ΨQ重復(fù)排列切割的位點(diǎn)：G、A之間斷裂的化學(xué)鍵是：磷酸二酯鍵SmaⅠ平末端平末端1、種類：2、作用部位：E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶

磷酸二酯鍵DNA連接酶連接黏性（平）末端，可形成重組的DNA分子二、“分子縫合針”

—DNA連接酶

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低T4DNA連接酶要想使兩個(gè)不同的DNA分子重組，必須用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別（二）“分子縫合針”——DNA連接酶3、兩種連接酶的區(qū)別：DNA連接酶與DNA聚合酶比較DNA聚合酶DNA連接酶相同不同作用對(duì)象模板形成磷酸二酯鍵單個(gè)脫氧核苷酸DNA片斷需要不需要三、基因的載體——“分子運(yùn)輸車”載體必須具備的條件：

1、能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存；

2、具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接；

3、具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。（如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等）

4、對(duì)受體細(xì)胞無害載體的作用：

1、將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。

2、利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞內(nèi)，對(duì)外源基因進(jìn)行大量復(fù)制。常用的載體有：

質(zhì)粒，λ噬菌體的衍生物，動(dòng)植物病毒等常用的載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的

為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？

通過長期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。

目的基因主要是指_____________________，

也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因供體生物細(xì)胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細(xì)菌)、人胰島素基因等。步驟一:目的基因的獲取原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞基因編碼區(qū)（編碼序列）：能指導(dǎo)有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，即能夠編碼蛋白質(zhì)非編碼區(qū)（調(diào)控序列）：位于編碼區(qū)上游和編碼區(qū)下游的DNA序列，雖不能指導(dǎo)有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，但有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，如啟動(dòng)子、終止子等真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞基因編碼區(qū)（間隔、不連續(xù)）外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列非編碼區(qū)：與原核生物具有相似功能的啟動(dòng)子、終止子1）從基因文庫中獲取目的基因2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3）人工合成（DNA合成儀）

種類：基因組文庫：部分基因文庫（如cDNA文庫）：含有一種生物的全部基因含有一種生物的部分基因根據(jù)基因的有關(guān)信息，如基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA等可以從基因文庫中得到所需的目的基因。獲得目的基因的方法適合基因比較小，且核苷酸序列已知原理、過程、條件、擴(kuò)增形式1）從基因文庫中獲取目的基因1）從基因文庫中獲取目的基因基因組DNA文庫基因組DNA文庫cDNA文庫鳥槍法人工合成以原核生物為主真核生物cDNA文庫和基因組文庫對(duì)比目的性強(qiáng)比較盲目工作量相對(duì)小大PCR技術(shù)—多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

原理：前提：原料：PCR擴(kuò)增儀DNA雙鏈復(fù)制已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的兩條鏈為模板變性（90--95℃）復(fù)性延伸1.變性：目的基因DNA受熱變性，解鏈為單鏈；2.復(fù)性：引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合；3.延伸：合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸。55

55（55--60℃）（70--75℃）指數(shù)形式擴(kuò)增1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________?！?/p>

核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）。限制酶黏性末端同種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同步驟二:基因表達(dá)載體的構(gòu)建●目的基因●啟動(dòng)子在基因的首端，它是RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合的部位●終止子在基因的尾端●標(biāo)記基因便于篩選檢驗(yàn)基因表達(dá)載體的組成：目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。常用的受體細(xì)胞：動(dòng)植物細(xì)胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞，并在其中維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程，稱為轉(zhuǎn)化。步驟三:將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞導(dǎo)入方法植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(最常用)基因槍法花粉管通道法—顯微注射法—感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物。

Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上1.微生物作受體細(xì)胞原因：將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞3.轉(zhuǎn)化方法：大腸桿菌繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少

處理細(xì)胞→

細(xì)胞→表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→_________細(xì)胞吸收DNA分子。Ca2+感