拮抗菌Gzf-2固態(tài)發(fā)酵產孢條件的篩選及優(yōu)化畢業(yè)論文(設計)

PAGEPAGE本科畢業(yè)論文（設計）論文（設計）題目：拮抗菌Gzf-2固態(tài)發(fā)酵產孢條件的篩選及優(yōu)化貴州大學本科畢業(yè)論文（設計）誠信責任書本人鄭重聲明：本人所呈交的畢業(yè)論文（設計），是在導師的指導下獨立進行研究所完成。畢業(yè)論文（設計）中凡引用他人已經發(fā)表或未發(fā)表的成果、數(shù)據(jù)、觀點等，均已明確注明出處。特此聲明。論文（設計）作者簽名：日期：貴州大學畢業(yè)論文（設計）目錄摘要Abstract前言1木霉的概述2木霉發(fā)酵的影響因素3我國木霉發(fā)酵的研究狀況4研究的目的及意義第二章材料與方法1實驗材料1.1實驗菌株1.2實驗試劑1.3實驗器材1.4培養(yǎng)基2實驗方法2.1菌株的活化 2.2孢子懸浮液的制備2.3產孢量的測定方法2.4單因素條件的優(yōu)化2.4.1溫度的篩選2.4.2接種量的篩選2.4.3pH值的篩選2.4.4碳源的篩選2.4.5氮源的篩選2.4.6其他添加量的篩選2.4.7光照的篩選2.4.8攪拌的篩選結果與分析1單因素優(yōu)化結果1.1溫度對綠色木霉產孢量的影響1.2接種量對綠色木霉產孢量的影響1.3pH值的篩選對綠色木霉產孢量的影響1.4碳源對綠色木霉產孢量的影響1.5氮源對綠色木霉產孢量的影響1.6其他添加量對綠色木霉產孢量的影響1.7光照對綠色木霉產孢量的影響1.8攪拌對綠色木霉產孢量的影響2Plackett-Burman（PB）試驗 3最陡爬坡試驗 4中心復合試驗 4.1中心復合試驗結果 4.2二次回歸模型的建立及檢驗 4.3響應曲面的擬合 4.4最優(yōu)條件的確定 5最優(yōu)條件的驗證試驗 第四章小結與討論參考文獻致謝拮抗菌Gzf-2固態(tài)發(fā)酵產孢條件的篩選及優(yōu)化摘要本實驗運用Minitab軟件，將Plackett-Burman試驗設計與響應面分析法相結合，采用麩皮固態(tài)發(fā)酵，對綠色木霉Gzf-2菌株的產孢條件進行優(yōu)化，結果表明，光照及攪拌對提高Gzf-2菌株產孢量有較大的顯著效應。優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為，在麩皮培養(yǎng)基的基礎上，加入MgSO41.6‰、葡萄糖10%、（NH4）2SO41‰、CaCO31.6%、CaSO40.8%，每日光照12.17h，培養(yǎng)47.36h后進行攪拌，在此條件下，Gzf-2菌株產孢量達到5.93×109個/mL，比優(yōu)化前提高了2.34倍。關鍵詞：綠色木霉；固態(tài)發(fā)酵；Plackett-Burman試驗設計；響應面分析法ScreeningandoptimizationofantagonisticbacteriaGZF-2solid-statefermentationconditionsofsporulationAbstractInthisstudy,theuseofMinitabsoftware,thePlackett-Burmanexperimentaldesignandresponsesurfaceanalysiscombinedbransolid-statefermentationofTrichodermavirideGzf-2strainssporulationconditionstooptimizetheresultsshowthatthelightandstirtoimproveGzf-2strainsporulationsignificanteffect.Optimizedcultureconditions,onthebasisofthebranmedium,addMgSO41.6‰,glucose10%,(NH4)2SO41‰,CaCO31.6%,CaSO40.8%dailyillumination12.17hculture47.36hstirring,inthiscondition,Gzf-2strainsporulationreached5.93×109/mLand2.34timeshigherthanbefore.Keywords:Trichodermaviride;solid-statefermentation;Plackett-Burmanexperimentaldesign;ResponseSurfaceMethodology.前言1木霉（Trichodermaspp）的概述木霉菌(Trichodermaspp)為絲狀真菌，屬于半知菌類，絲孢綱,絲孢目,叢梗孢科,它的有性階段為子囊菌亞門,核菌綱,肉座目,肉座科的肉座菌屬；廣泛存在于植物葉面、根際種子、球莖和土壤等生態(tài)環(huán)境中。木霉菌落生長速度很快，棉絮狀或致密叢束狀，菌落表面多數(shù)是綠色的，有一些是黃色的。菌絲透明，有隔，分支多。厚垣孢子有些有，有些無，間生或頂生，無色，壁光滑。分生孢子梗是菌絲的短側枝，分生孢子梗上對生或互生分支，分支上又可繼續(xù)分支，形成二級和三級分支，分支角度成銳角或幾乎成直角，分支的末端即為小梗。分生孢子由小梗相繼生出而靠黏液把它們聚集成球形的孢子頭，分生孢子近球形或橢圓形，壁光滑或粗糙，透明或亮黃色。木霉菌有很多種類，如綠色木霉（T.viride）、鉤狀木霉（T.hamatum）、康氏木霉（T.koningii）、哈茨木霉（T.harzinum）長枝木霉（T.longibrachiatum）、深綠木霉（T.atroviride）、頂孢木霉（T.fertile）[1]等。綠色木霉（T.viride）菌株在PDA平板上生長快速，初期菌絲成白色致密的基質菌絲，；4d左右菌絲成蜘蛛網狀的氣生菌絲，綠色，菌落反面為無色，產生大量孢子，孢子為厚垣孢子。菌絲透明，壁光滑，有隔，分枝多；厚垣孢子間生于菌絲中或頂生于短側枝上，多數(shù)為球形，極少數(shù)為橢圓形，瓶梗對生或輪生，次級分枝多，3-5個輪生，基部收縮，中間膨大，終極瓶梗不收縮，基部延長。孢壁具有明顯的小疣狀突起，在顯微鏡下單個孢子為淡綠色。木霉菌的適應性強，生長迅速，能產生大量的孢子和抑菌代謝產物，在植物病原真菌如煙草黑脛病菌、鐮刀菌、鏈格孢菌、絲核菌、毛盤菌、輪枝孢菌、腐霉菌、肉座殼菌等病害的生物防治中有廣泛的研究，是世界公認的高效生防菌株。木霉是一種重寄生真菌，其菌絲與寄主的菌絲平行、趨向生長、識別、接觸、纏繞、附著、插入寄主菌絲內等方式進行寄生，直接從寄主菌絲體內吸取營養(yǎng)物質，從而影響寄主的生長與發(fā)育。木霉在寄生過程中還分泌產生一些抑菌代謝產物和細胞壁降解酶類，如木霉素、抗菌肽、綠膠霉素、膠毒素、綠毛菌醇、綠粘帚霉毒素、綠毛霉素及孢壁降解酶（纖維素酶、幾丁質酶、蛋白酶、葡聚糖酶等）等抑制其他病原菌的生長，以達到防治的目的。2木霉發(fā)酵的影響因素2.1碳源木霉利用碳源能力很強，不僅能夠利用葡萄糖、蔗糖，而且對多糖（纖維素、半纖維素）和相關多聚物（如幾丁質）有較強的降解能力。不同碳源物質對木霉的生長及產孢有一定的影響，多數(shù)木霉對葡萄糖的利用率較高；有研究發(fā)現(xiàn)，不同碳源物質還影響木霉的生物防治效果。2.2氮源木霉可以利用簡單和復雜的氮源，如銨鹽、硝酸鹽、蛋白胨、氨基酸等。在有碳水化合物作碳源的培養(yǎng)基中，木霉優(yōu)先利用銨鹽類。氮源能促進菌絲生長，在提高木霉產孢量的發(fā)酵培養(yǎng)基中應控制其氮源用量，不能過多。2.3礦質元素多數(shù)木霉可以利用無機磷酸鹽和硫酸鹽作為磷和硫的來源，還有一些礦質元素對木霉的營養(yǎng)生長和產孢也產生影響，如K、Ca、Fe、Mn、Cu、Zn、Mo等。2.4生長因子和維生素生長因子和維生素對于大多數(shù)野生型木霉不是必須營養(yǎng)成分，但生物素和維生素B1能夠促進木霉的生長。2.5二氧化碳和氧氣木霉是專性需氧菌，氧氣的供應及線粒體的活性對纖維素酶的產生有一定的影響，低于最適氧分壓的條件有利于纖維素酶的產生。二氧化碳會影響木霉的生長和產孢，二氧化碳分壓的升高能促進木霉菌絲的生長。2.6其他因素接種量、pH值、初始含水量、培養(yǎng)溫度、光照、培養(yǎng)時間等因素對木霉的生長和產孢也有極大的影響，在進行發(fā)酵試驗的過程中應考慮到這些因素的影響。3我國木霉發(fā)酵的研究狀況孫斐[2]等以麩皮和玉米芯為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基主要的原料，篩選擬康氏木霉SDTP1菌株的最大產孢量。采用單因素試驗法，對麩皮與玉米芯的比例，培養(yǎng)基含水量，接種量，其他添加劑進行篩選優(yōu)化。結果表明，麩皮與玉米芯按8:2，含水量為55%-60%，加入0.1%KNO3，1%CaSO4,1%蔗糖，接種量為10%；在28℃，以3m/s速度通無菌空氣的發(fā)酵條件下培養(yǎng)120h，其產孢量達到1×109以上。他們還采用淺盤式固態(tài)發(fā)酵在優(yōu)化的單因素條件下模擬大規(guī)模發(fā)酵過程，結果表明，每克發(fā)酵產物產孢量達到1.34×109個。夏斯琴[3]等以綠色木霉T4為菌株，以麩皮作為固態(tài)發(fā)酵基質，通過單因素試驗和正交試驗，研究碳源、氮源、初始接種量、培養(yǎng)溫度及初始含水量及微量元素對該菌株產孢的影響。結果表明，在麩皮培養(yǎng)基的基礎上，加入10%葡萄糖，1‰(NH4)2SO4，2‰KH2PO4，4‰MgSO4，6‰CaCO3，初始接種量1×105個.(g干基質)-1，初始含水量60%，28℃發(fā)酵培養(yǎng)7d，產孢量達到4.47×1010個.(g干基質)-1。肖龍龍[4]等對綠色木霉的發(fā)酵條件進行篩選，以察氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，對其碳源、氮源、生物激活劑、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時間進行篩選。結果表明，加入3‰硝酸鈉,1%蔗糖，2‰生物激活劑，在30℃下培養(yǎng)4d，該綠色木霉的產孢量較高。劉霞[5]等研究不同發(fā)酵條件對綠色木霉抑菌的效果的影響，考察了不同碳源、氮源、初始pH值、接種量、裝樣量、發(fā)酵天數(shù)等因素。結果表明，最適發(fā)酵條件為：3%葡萄糖，0.2%(NH4)2SO4，初始pH為6，接種量為6%，裝樣量為60mL/250mL，發(fā)酵5d，在此條件下其抑菌效果最佳。申屠旭萍[6]等在單因素試驗的基礎上，采用Plackett-Burman試驗設計與響應面分析法，對哈茨木霉生產木霉素的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結果表明，葡萄糖濃度42.8g/L，牛肉膏15g/L，蛋白胨50g/L，MnCl0.5g/L，NH4Cl0.1g/L，接種量1.39mL，發(fā)酵時間102.88h，pH6.0，溫度28℃，轉速180r/min，在該發(fā)酵條件下，木霉素的產量可達147.44mg/L。黃雪蓮[7]等采用響應面分析法對綠色木霉菌的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，在前期試驗的基礎上，對葡萄糖、丙氨酸、磷酸二氫鉀3個顯著因素的添加量進行中心組合試驗，通過試驗建立二次回歸方程，運用軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理和分析，應用響應面分析法進行優(yōu)化。結果表明，葡萄糖、丙氨酸、磷酸二氫鉀三者添加量分別為2.11g/dL、0.15g/dL、0.30g/dL時，綠色木霉菌菌落直徑達到78.00mm，與預測值77.87mm較接近。李淑瑞[8]等對綠色木霉液體培養(yǎng)基發(fā)酵產殼聚糖酶的培養(yǎng)基利用響應面方法進行優(yōu)化試驗，篩選得到了最佳產酶培養(yǎng)基組成：麩皮0.5%、棉籽餅粉4.79%、Avicel2.56%、玉米芯1.03%、KH2PO40.2%、MgSO40.03%、(NH4)2SO40.2%、CaCl20.03%,pH自然,在此條件下，綠色木霉的最大產殼聚糖酶活為2.00IU/mL。4研究的目的及意義多數(shù)對木霉發(fā)酵的研究僅限于其單因子法和正交試驗設計法進行培養(yǎng)基的優(yōu)化。單因素篩選只能考察一種因素的影響，而考察的因素間會存在交互作用，該方法并非總能篩選出最優(yōu)條件。正交試驗注重如何合理安排試驗，可以同時考察幾種因素，尋找最佳因素水平組合，但不能以一個明確的函數(shù)表達式體現(xiàn)因素和響應值之間的關系，從而不能得到最佳試驗優(yōu)化條件[12]。而運用Minitab軟件，將Plackett-Burman試驗設計與響應面分析法相結合，對篩選出的單因素進一步優(yōu)化。在其他微生物發(fā)酵的優(yōu)化中，已廣泛運用PB試驗和響應面法相結合進行發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，得到了良好的效果。麩皮是農副產品，來源豐富、價格低廉，且富含纖維素和半纖維素，是微生物生長的優(yōu)良碳源。以麩皮作為木霉發(fā)酵的基礎培養(yǎng)基，大大降低了成本，產品干孢子形式存在，相對液體發(fā)酵，能長時間儲存和運輸，并具有較高的活力，作為固體制劑，在大田試驗使用上比較方便。因此，今后在木霉發(fā)酵中，以麩皮作為基礎培養(yǎng)基，進行單因素試驗篩選后，將Plackett-Burman試驗設計與響應面分析法相結合，對篩選出的單因素進一步優(yōu)化，這一方法將得到廣泛運用。貴州省畢節(jié)煙葉產區(qū)煙草赤星病比較嚴重，綠色木霉對赤星病有較好的拮抗效果。本實驗室篩選出Gzf-2菌株對該煙區(qū)的赤星病有較好的拮抗作用；為了獲得大量Gzf-2菌株的生防菌劑，本試驗對其固態(tài)發(fā)酵產孢條件進行篩選。經過單因素的篩選優(yōu)化麩皮培養(yǎng)基，Gzf-2菌株的產孢量有所提高，但任然有提高的空間，試驗通過Plackett-Burman試驗設計與響應面分析法相結合對其進一步優(yōu)化，得到了較好的效果。綠色木霉對煙草赤星病的生物防治減少農藥的使用，從而降低了對環(huán)境的污染和人體健康的危害；本試驗為今后的大田試驗生防菌劑的大量制備奠定基礎。材料與方法1實驗材料1.1實驗菌株實驗所用菌株綠色木霉由微生物實驗室從畢節(jié)地區(qū)煙地分離保藏，保種編號為Gzf-2。1.2實驗試劑試劑名稱產地葡萄糖成都金山化學試劑有限公司蔗糖成都金山化學試劑有限公司淀粉天津市協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司（NH4）2SO4成都金山化學試劑有限公司蛋白胨上海盛思生化科技有限公司大豆蛋白胨北京奧博星生物技術有限責任公司KNO3成都金山化學試劑有限公司NaNO3重慶茂業(yè)化學試劑有限公司CaSO4成都科龍化工試劑廠MgSO4重慶茂業(yè)化學試劑有限公司CaCO3成都金山化學試劑有限公司NaCl重慶川東化工（集團）有限責任公司KCl重慶川東化工（集團）有限責任公司1.3實驗器材儀器型號產地高壓滅菌鍋LDZX—50KBS型上海申安醫(yī)療器械廠光學顯微鏡ECLIPSEE100NIKON公司超凈工作臺SW—CJ—IFD型蘇州凈化有限公司精密電子天平BS110S北京賽多利天平公司電熱恒溫培養(yǎng)箱HH.B11.420上海躍進醫(yī)療器械廠光照培養(yǎng)箱SPX-300B-G上海博訊實業(yè)有限公司海爾冰箱BCD-215196TJ青島海爾股份有限公司托盤天平HC-TP11-5上海精科天平公司血球計數(shù)板XB.K.25上海市求精生化試劑儀器有限公司其它常用儀器：移液槍、試管、培養(yǎng)皿等。1.2培養(yǎng)基馬鈴薯培養(yǎng)基：簡稱PDA，馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂18g、水1000mL、pH自然。馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時，然后用紗布過濾，再加葡萄糖及瓊脂，溶化后補水至1000mL，121℃滅菌30min。麩皮培養(yǎng)基：麩皮30g、水30mL、pH自然。稱取麩皮30g，按含水率50%比例加水30mL，拌勻，靜置6h-8h，115℃滅菌30min。2實驗方法2.1菌株的活化從4℃保存的冰箱中將Gzf-2菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)活化。2.2孢子懸浮液的制備將活化培養(yǎng)5天后的Gzf-2菌株用10mL無菌水將孢子洗下，倒入90mL燒杯中，取其中1mL孢子懸浮液稀釋10倍于、100倍，用血球計數(shù)板計數(shù)，記錄數(shù)據(jù)，貼好標簽，將孢子懸浮液保存于4℃冰箱中待用。2.3產孢量的測定方法血球計數(shù)板測定產孢量：計數(shù)公式：以25個中方格的計數(shù)板為例，設5個中方格的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，則1mL菌液中的總菌數(shù)=×25×10?×B。計數(shù)步驟：a、將血球計數(shù)板用自來水沖洗干凈，用洗耳球或吹風機吹干；b、取干凈的蓋玻片蓋在計數(shù)室上，用移液槍將搖勻的稀釋菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數(shù)室，再用鑷子輕壓蓋玻片，以免菌液過多將蓋玻片頂起而改變了計數(shù)室的容積，加樣后靜置5min，使菌體自然沉降；c、顯微鏡下觀察計數(shù)：計數(shù)原則，計上不由下，計左不由右；d、清洗計數(shù)板。2.4單因素條件的優(yōu)化2.4.1溫度的篩選麩皮培養(yǎng)基：麩皮與自來水按1：1的比例拌勻，靜置6-8h，滅菌（本實驗用培養(yǎng)皿裝麩皮，每個實驗處理三個重復，共稱麩皮30g，加水30mL，分裝到三個培養(yǎng)皿中）。滅菌前后麩皮含水量可能改變，經檢驗，滅菌前后麩皮培養(yǎng)基含水量變化不大（減少0.2g左右），可忽略。將保存在冰箱中的孢子懸浮液稀釋為1×107個/mL×2mL接種于麩皮培養(yǎng)基上，在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃恒溫培養(yǎng)5天（每個處理3個重復），用血球計數(shù)板測定產孢量。2.4.2接種量的篩選將麩皮按含水率為50%拌濕，靜置6-8h，滅菌；按接種量為1×108個/mL、1×107個/mL、1×106個/mL、1×105個/mL、1×104個/mL、1×103個/mL、分別接種到麩皮培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)，5天后測定產孢量（每個處理三個重復）。2.4.3初始pH值得篩選稱取一定量的麩皮，含水率為50%；將水的pH值用1mol/LNaOH、1mol/LHCl調為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0后與麩皮拌濕，靜置6-8h，滅菌；接種（1×107個/mL×2mL），28℃恒溫培養(yǎng)，5天后測定產孢量。2.4.4碳源的篩選不同碳源的篩選向麩皮培養(yǎng)基中分別加入10%淀粉；10%蔗糖；10%面粉；葡萄糖10%；對照組只加麩皮；每個處理三個重復，含水率為50%；攪拌靜置滅菌，接種，28℃恒溫培養(yǎng)，5天后測定產孢量。碳源添加量的篩選得到最佳碳源葡萄糖，其添加量分別為5%、10%、15%、20%，方法同上。2.4.5氮源的篩選不同氮源的篩選有機氮源：蛋白胨1%；大豆蛋白胨1%；豆粉10%；無機氮源：(NH4)2SO41‰:；NaNO31‰；KNO31‰；對照組只加麩皮；每個處理三個重復，將所加藥品溶于水中再與麩皮拌濕（含水率為50%）靜置6-8h，滅菌；接種（1×107個/mL×2mL），28℃恒溫培養(yǎng)，在第5天測定產孢量。氮源添加量的篩選得到最佳氮源(NH4)2SO4，其添加量分別為0.5‰、1‰、5‰、1%，方法同上。2.4.6其他添加量的篩選MgSO4的添加量向麩皮培養(yǎng)基中分別加入1‰、2‰、3‰、4‰的MgSO4；含水率為50%；攪拌靜置，滅菌；接種，28℃恒溫培養(yǎng)，5天后測定產孢量。CaCO3的添加量向麩皮培養(yǎng)基中分別加入1%、2%、3%、4%的CaCO3，方法同上。CaSO4的添加量向麩皮培養(yǎng)基中分別加入1%、2%、3%、4%的CaSO4，方法同上。2.4.7光照的篩選將麩皮按含水率為50%加水拌勻靜置，滅菌；接種，一組光照培養(yǎng)，另一組無光照培養(yǎng)，5天后測定產孢量。2.4.8攪拌的篩選將麩皮按含水率為50%加水拌勻靜置，滅菌；接種，分別培養(yǎng)24h、48h、72h、96h攪拌一次后繼續(xù)培養(yǎng)，5天后測定產孢量。結果與分析1單因素優(yōu)化結果1.1溫度對綠色木霉產孢量的影響溫度的影響溫度(℃)51015202528303540產孢量（×109個/mL)002.751.81.30培養(yǎng)溫度在5℃、10℃、40℃下，沒有觀察到菌絲的生長，可能是溫度過低和過高，抑制了菌絲的生長；培養(yǎng)溫度在15℃到20℃之間，菌絲生長緩慢，產孢時間比較晚，產孢量都比較低；培養(yǎng)溫度在25℃到30℃之間，菌絲生長快速，產孢時間較早；在30℃到35℃之間，菌絲生長逐漸緩慢，產孢量降低。由表可以看出，培養(yǎng)溫度在28℃時，產孢量最高。1.2接種量對綠色木霉產孢量的影響接種量的影響接種量（個/mL）1×1081×1071×1061×1051×1041×103產孢量（×109個/mL)1.752.92.5接種量在1×104個/mL和1×103個/mL時，菌絲生長相對較慢，其余接種量菌絲生長較快，由表可以看出，接種量在1×107個/mL時，產孢量最大，由此可知接種量的多少也可影響菌絲生長速度和產孢量。1.3pH值的篩選對綠色木霉產孢量的影響初始pH值的影響pH值1234567891011121314產孢量（×109個/mL）2.654.053.653.552.92.6201.4碳源對綠色木霉產孢量的影響碳源的影響碳源淀粉10%蔗糖10%面粉10%葡萄糖5%葡萄糖10%葡萄糖15%葡萄糖20%對照產孢量（×109個/mL)3.053.33.352.053.62.851.72.851.5氮源對綠色木霉產孢量的影響氮源的影響氮源蛋白胨大豆蛋白胨豆粉硫酸銨硝酸鈉硝酸鉀對照產孢量（×109個/mL)52.751.6無機鹽對綠色木霉產孢量的影響無機鹽離子的影響無機鹽（5%）硫酸銨碳酸鈣磷酸二氫鉀硫酸鎂氯化鉀氯化鈉對照產孢量（×109個/mL)2.451.7光照對綠色木霉產孢量的影響1.8攪拌對綠色木霉產孢量的影響2Plackett-Burman（PB）試驗Plackeet-Burman試驗設計方法是一種兩水平的試驗設計方法，它能以最少的試驗次數(shù)體現(xiàn)出各因素的主效應，能快速地從中篩選出最重要的幾個因素[3]。根據(jù)綠色木霉生長所需的營養(yǎng)，結合前期的單因素試驗，本試驗選用試驗次數(shù)N=13的試驗設計，對MgSO4、葡萄糖、（NH4）2SO4、CaCO3、CaSO4、光照、攪拌共7個因素進行試驗，篩選出影響綠色木霉產孢的重要因素，確定最佳試驗條件。試驗設計和各因素效應及評價見表1和表2。表1PB試驗因素水平水平因素X1X2X3X4X5X6X7MgSO4攪拌次數(shù)有無光照葡萄糖（NH4）2SO4CaCO3CaSO4-11.6‰0無10%0.8‰1.6%0.8%12‰1有12.5%1‰2%1%PB試驗設計及結果如表2，用Minitab軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到各因素對響應值Y（綠色木霉產孢量，個/mL）的影響效果分析如表3。表2PB試驗設計及結果序號X1X2X3X4X5X6X7Y(個/mL)1-11-1-1-1111.34×10921-11-1-1-111.84×10931-1-1-11118.48×1084-1-1-1111-17.36×1085-1111-1112.37×1096-1-1-1-1-1-1-13.01×1097111-111-12.14×1098-1-1111-111.95×1099-111-11-1-11.01×1091011-111-112.37×109111-111-11-12.32×1091211-11-1-1-12.88×109表3各因素效應及評價變量代碼變量統(tǒng)計分析效應標準誤TP重要性X1MgSO4-5.233×1071.264×108-0.210.8466X2攪拌次數(shù)8.210×1081.264×1083.250.0312X3有無光照1.051×1091.264×1084.160.0141X4葡萄糖1.803×1081.264×1080.710.5154X5（NH4）2SO49.700 ×1071.264×1080.380.7215X6CaCO3-9.667×1061.264×108-0.040.9717X7CaSO42.61×1091.264×1081.030.3603由表3的各因素效價評價可知，MgSO4、葡萄糖、（NH4）2SO4、CaCO3、CaSO4對Gzf-2產孢量無顯著影響，攪拌和光照對Gzf-2產孢量有顯著影響。3最陡爬坡試驗根據(jù)Plackeet-Burman試驗結果分析，確定主效應因素，對主效應因素進一步梯度篩選，進行最陡爬坡試驗。攪拌和光照為主效應因素,根據(jù)攪拌和光照兩個因素效應的大小設定變化方向和步長進行最陡爬坡試驗，其設計及結果見表4。表4最陡爬坡試驗設計及結果序號光照/h攪拌/h產孢量(個/mL)14123.71×10928243.75×109312485.70×109416724.66×109520963.61×1094中心復合試驗根據(jù)最陡爬坡試驗結果，得到中心點，按方程Z=X1-X2/ΔX（其中，Z為水平值，X1為水平值對應因素的求值，X2為中心點因素對應值，ΔX為因素閾值）[4]設定中心組合試驗自變量水平及中心組合試驗設計。4.1中心復合試驗結果根據(jù)表4試驗結果設計中心組合試驗，有兩個自變量，為使擬合響應方程具有旋轉性和通用性，選擇中心試驗數(shù)為5，星號臂長為1.414[5]。試驗設計及結果如表5、表6。表5中心組合試驗變量及其水平因素水平-1.414-1011.414x1，光照/h9.210121414.8x2，攪拌/h3136486065表6中心組合試驗設計及結果序號因素產孢量x1x21-1-14.72×10921-15.38 ×1093-114.77×1094114.93×1095-1.41404.96×10961.41404.83 ×10970-1.4145.04×109801.4145.13×1099005.75×10910005.98×10911005.88×10912005.94×10913005.97×1094.2二次回歸模型的建立及檢驗根據(jù)Minitab軟件得到擬合二階模型公式：Y=5.90×109+7.95×107X1-3.41×107X2-5.15×108X12-1.25×108X1X2-4.20×108X22；根據(jù)此公式預測得到，當X1=0.08373，X2=-0.05311時Ymax=5.91×1097.54×107；即每日光照12.17h，47.36h攪拌時，綠色木霉Gzf-2的最大產孢量為5.91×1097.54×107個/mL。4.3響應曲面的擬合應用Minitab軟件響應面分析可作出光照和攪拌的三維空間響應面圖和二維等高線圖，如圖1、圖2。圖1圖24.4最優(yōu)條件的確定5最優(yōu)條件的驗證試驗為了驗證試驗模型的可行性，在初始條件和最佳發(fā)酵條件（MgSO41.6‰、葡萄糖10%、（NH4）2SO41‰、CaCO31.6%、CaSO40.8%，每日光照12.17h，培養(yǎng)47.36h后進行攪拌）下進行驗證試驗。培養(yǎng)7天后，測得初始條件下的產孢量為2.53×109個/mL；優(yōu)化后的產孢量為5.93×109個/mL，與模型預測值相近。優(yōu)化后比優(yōu)化前的產孢量提高了2.34倍。第四章小結與討論參考文獻[1]孫軍，段玉璽，呂國忠.遼寧木霉屬真菌的形態(tài)分類研究[J].菌物研究，2006，4（2）：38-44.[2]孫斐，陳靠山，張鵬英.固態(tài)發(fā)酵麩皮和玉米芯生產擬康氏木霉孢子的研究[J].中國農學通報，2010,26（6）：236-239.[3]夏斯琴，王偉.綠色木霉T4的固體發(fā)酵工藝及其制劑穩(wěn)定性的研究[J].化學與生物工程，2008,25（12）：52-56.[4]肖龍龍，張崇玉，付責中.綠色木霉產孢條件的優(yōu)化[J].山地農業(yè)生物學報，2012,31（1）：036-039.[5]劉霞，王燕，安磊等.綠色木霉發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].中國食品添加劑試劑研究，2009，（3）:100-103.[6]申屠旭萍，石一，俞曉平.哈茨木霉發(fā)酵產木霉素的培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].中國生物防治，2009,25（4）：348-354.[7]黃雪蓮，于新.響應面法優(yōu)化綠色木霉菌培養(yǎng)基[J].食品與生物技術學報，2011,30（5）:740-744.[8]李淑瑞，余曉斌，孫婷.綠色木霉產殼聚糖酶培養(yǎng)基[J].食品工業(yè)科技，2009,30（10）：178-180.致謝基于C8051F單片機直流電動機反饋控制系統(tǒng)的設計與研究基于單片機的嵌入式Web服務器的研究MOTOROLA單片機MC68HC（8）05PV8/A內嵌EEPROM的工藝和制程方法及對良率的影響研究基于模糊控制的電阻釬焊單片機溫度控制系統(tǒng)的研制基于MCS-51系列單片機的通用控制模塊的研究基于單片機實現(xiàn)的供暖系統(tǒng)最佳啟停自校正（STR）調節(jié)器單片機控制的二級倒立擺系統(tǒng)的研究基于增強型51系列單片機的TCP/IP協(xié)議棧的實現(xiàn)基于單片機的蓄電池自動監(jiān)測系統(tǒng)基于32位嵌入式單片機系統(tǒng)的圖像采集與處理技術的研究基于單片機的作物營養(yǎng)診斷專家系統(tǒng)的研究基于單片機的交流伺服電機運動控制系統(tǒng)研究與開發(fā)基于單片機的泵管內壁硬度測試儀的研制基于單片機的自動找平控制系統(tǒng)研究基于C8051F040單片機的嵌入式系統(tǒng)開發(fā)基于單片機的液壓動力系統(tǒng)狀態(tài)監(jiān)測儀開發(fā)模糊Smith智能控制方法的研究及其單片機實現(xiàn)一種基于單片機的軸快流CO〈,2〉激光器的手持控制面板的研制基于雙單片機沖床數(shù)控系統(tǒng)的研究基于CYGNAL單片機的在線間歇式濁度儀的研制基于單片機的噴油泵試驗臺控制器的研制基于單片機的軟起動器的研究和設計基于單片機控制的高速快走絲電火花線切割機床短循環(huán)走絲方式研究基于單片機的機電產品控制系統(tǒng)開發(fā)基于PIC單片機的智能手機充電器基于單片機的實時內核設計及其應用研究基于單片機的遠程抄表系統(tǒng)的設計與研究基于單片機的煙氣二氧化硫濃度檢測儀的研制基于微型光譜儀的單片機系統(tǒng)單片機系統(tǒng)軟件構件開發(fā)的技術研究基于單片機的液體點滴速度自動檢測儀的研制基于單片機系統(tǒng)的多功能溫度測量儀的研制基于PIC單片機的電能采集終端的設計和應用基于單片機的光纖光柵解調儀的研制氣壓式線性摩擦焊機單片機控制系統(tǒng)的研制基于單片機的數(shù)字磁通門傳感器基于單片機的旋轉變壓器-數(shù)字轉換器的研究基于單片機的光纖Bragg光柵解調系統(tǒng)的研究單片機控制的便攜式多功能乳腺治療儀的研制基于C8051F020單片機的多生理信號檢測儀基于單片機的電機運動控制系統(tǒng)設計Pico專用單片機核的可測性設計研究基于MCS-51單片機的熱量計基于雙單片機的智能遙測微型氣象站MCS-51單片機構建機器人的實踐研究基于單片機的輪軌力檢測基于單片機的GPS定位儀的研究與實現(xiàn)基于單片機的電液伺服控制系統(tǒng)用于單片機系統(tǒng)的MMC卡文件系統(tǒng)研制基于單片機的時控和計數(shù)系統(tǒng)性能優(yōu)化的研究基于單片機和CPLD的粗光柵位移測量系統(tǒng)研究單片機控制的后備式方波UPS提升高職學生單片機應用能力的探究基于單片機控制的自動低頻減載裝置研究基于單片機控制的水下焊接電源的研究基于單片機的多通道數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)基于uPSD3234單片機的氚表面污染測量儀的研制基于單片機的紅外測油儀的研究96系列單片機仿真器研究與設計基于單片機的單晶金剛石刀具刃磨設備的數(shù)控改造基于單片機的溫度智能控制系統(tǒng)的設計與實現(xiàn)基于MSP430單片機的電梯門機控制器的研制基于單片機的氣體測漏儀的研究基于三菱M16C/6N系列單片機的CAN/USB協(xié)議轉換器基于單片機和DSP的變壓器油色譜在線監(jiān)測技術研究基于單片機的膛壁溫度報警系統(tǒng)設計基于AVR單片機的低壓無功補償控制器的設計基于單片機船舶電力推進電機監(jiān)測系統(tǒng)基于單片機網絡的振動信號的采集系統(tǒng)基于單片機的大容量數(shù)據(jù)存儲技術的應用研究基于單片機的疊圖機研究與教學方法實踐基于單片機嵌入式Web服務器技術的研究及實現(xiàn)基于AT89S52單片機的通用數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)基于單片機的多道脈沖幅度分析儀研究機器人旋轉電弧傳感角焊縫跟蹤單片機控制系統(tǒng)基于單片機的控制系統(tǒng)在PLC虛擬教學實驗中的應用研究基于單片機系統(tǒng)的網絡通信研究與應用基于PIC16F877單片機的莫爾斯碼自動譯碼系統(tǒng)設計與研究基于單片機的模糊控制器在工業(yè)電阻爐上的應用研究基于雙單片機沖床數(shù)控系統(tǒng)的研究與開發(fā)基于Cygnal單片機的μC/OS-Ⅱ的研究基于單片機的一體化智能差示掃描量熱儀系統(tǒng)研究基于TCP/IP協(xié)議的單片機與Internet互聯(lián)的研究與實現(xiàn)變頻調速液壓電梯單片機控制器的研究基于單片機γ-免疫計數(shù)器自動換樣功能的研究與實現(xiàn)基于單片機的倒立擺控制系統(tǒng)設計與實現(xiàn)單片機嵌