細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)

試驗(yàn)用具一、材料和標(biāo)本乳鼠、HeLa細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞）二、器材和儀器手術(shù)器械、平皿、培養(yǎng)瓶、吸管、離心管（滅菌后備用）、酒精燈、燒壞、超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡。三、試劑含有5%小牛血清MEM培養(yǎng)液、0.01mo1／LPBS，0.25%胰蛋白酶／0.02%EDTA混合消化液、75%乙醇。細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)第1頁(yè)試驗(yàn)內(nèi)容

一、原代細(xì)胞培養(yǎng)

(一)原理細(xì)胞培養(yǎng)（Cellculture）是模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，將細(xì)胞從機(jī)體中取出，在人工條件下使其生存、生長(zhǎng)、繁殖和傳代，進(jìn)行細(xì)胞生命過(guò)程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問(wèn)題研究。由體內(nèi)直接取出組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細(xì)胞離體時(shí)間短，性狀與體內(nèi)相同，適合用于研究。普通說(shuō)來(lái)，幼稚狀態(tài)組織和細(xì)胞，如：動(dòng)物胚胎、幼仔臟器等更輕易進(jìn)行原代培養(yǎng)。細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)第2頁(yè)試驗(yàn)方法單層細(xì)胞培養(yǎng)法酶消化組織使其分離成單個(gè)細(xì)胞或較小細(xì)胞團(tuán)，接種培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)法把組織小塊（0.5－1mm3）直接貼附培養(yǎng)瓶壁，細(xì)胞自組織塊邊緣向外長(zhǎng)出生長(zhǎng)暈，最終連接成片形成單層細(xì)胞。此次試驗(yàn)采取組織塊培養(yǎng)法。細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)第3頁(yè)操作步驟1．取材頸椎脫位法使乳鼠快速死亡，把整個(gè)動(dòng)物浸入盛有75%乙醇燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺(tái)。用消過(guò)毒剪刀剪開(kāi)用碘酒和乙醇再次消毒后皮膚，剖腹取出肝臟或腎臟，置于無(wú)菌平皿中。2．切割Hanks液清洗，移入青霉素小瓶或表面皿上，眼科手術(shù)剪刀將組織重復(fù)剪碎，直到成0.5－lmm3左右小塊，再用吸管加入2－3滴細(xì)胞培養(yǎng)液，使組織塊懸浮在培養(yǎng)液中。細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)第4頁(yè)3．接種用吸管分次吸收組織塊懸液，將其均勻分布在培養(yǎng)瓶底壁上，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入2－3ml培養(yǎng)液，蓋好，做好標(biāo)識(shí)，二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2－3h后，組織塊牢靠貼壁，遲緩翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液浸泡組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)第5頁(yè)4．觀察組織塊靜止培養(yǎng)2－3d后，天天小心取出觀察。注意有沒(méi)有污染，貼壁組織塊邊緣有沒(méi)有細(xì)胞長(zhǎng)出。另外，依據(jù)培養(yǎng)液顏色改變，補(bǔ)加或更換培養(yǎng)液，除去懸浮組織塊。普通細(xì)胞生長(zhǎng)良好，約10－15天長(zhǎng)成致密單層，這時(shí)能夠傳代培養(yǎng)。細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)第6頁(yè)細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)第7頁(yè)二、傳代細(xì)胞培養(yǎng)（了解）（一）原理體外培養(yǎng)原代細(xì)胞或細(xì)胞株要在體外連續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，方便取得穩(wěn)定細(xì)胞株或得到大量同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種延續(xù)。培養(yǎng)細(xì)胞形成單層匯合以后，因?yàn)槊芏冗^(guò)大生存空間不足而引發(fā)營(yíng)養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)細(xì)胞分散，從容器中取出，以1：2或1：3以上比率轉(zhuǎn)移到另外容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)第8頁(yè)操作步驟1.