精選血清清蛋白、γ球蛋白的分離、提純與鑒定實(shí)驗(yàn)報(bào)告資料

生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)名稱-(TitleofExperimetn)實(shí)驗(yàn)日期實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)(DateofExperiment)指導(dǎo)老師(Partner)(Instructor)教師簽名批改日期(TotalScore)(Signature)(Date)30XX】實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握鹽析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法2、掌握凝膠層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法3、掌握離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法4、掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法5、了解柱層析技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理：1、蛋白質(zhì)的分離和純化是研究蛋白質(zhì)化學(xué)及其生物學(xué)功能的重要手段。2、不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度及等電點(diǎn)等都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別，可分離純化各種蛋白質(zhì)。3、鹽析法：鹽析法是在蛋白質(zhì)溶液中，加入無機(jī)鹽至一定濃度或達(dá)飽和狀態(tài)，可使蛋白質(zhì)在水中溶解度降低，從而分離出來。蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜減弱乃至消失。中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。4、離子交換層析:離子交換層析是指流動(dòng)相中的離子和固定相上的離子進(jìn)行可逆的交換，利用化合物的電荷性質(zhì)及電荷量不同進(jìn)行分離。5pH7.4。它們在pH8.6的緩沖液中均解離帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。由于血清中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，因而在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分離為清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5條區(qū)帶。實(shí)驗(yàn)材料：人混合血清DEAE纖維離子交換層析柱醋酸銨緩沖溶液葡聚糖凝膠（G-25)層析柱飽和硫酸銨溶液20%磺基水楊酸氨基黑染色液1%BaCl溶液2漂洗液pH8.6巴比妥緩沖溶液電泳儀、電泳槽DEAE纖維素離子交換層析（純化）→醋酸纖維素薄膜電泳（純度鑒定）實(shí)驗(yàn)步驟：（一）鹽析+凝膠柱層析除鹽：0.8ml)））滴滴NHAC4用NHAC4用NHAC4過）1磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì)過）用4NHAC緩4磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì)2管-42)4（三）醋酸纖維素薄膜電泳：1-+點(diǎn)樣線點(diǎn)樣區(qū)（粗面）1.5cm點(diǎn)樣線盡量點(diǎn)得細(xì)窄而均勻,寧少勿多2、電泳：①薄膜粗面向下②點(diǎn)樣端置陰極端③兩端緊貼在濾紙鹽橋上，膜應(yīng)輕輕拉平電壓：110V時(shí)間：50min3、染色和漂洗：電泳完畢后，關(guān)閉電源，將膜取出，直接浸于染色液中5min。取出膜，盡量瀝凈染色液，移入漂洗液中浸洗脫色（一般更換2顏色脫凈為止。取出膜，用濾紙吸干即可。注意事項(xiàng)：1、所用血清應(yīng)新鮮，無沉淀物及細(xì)菌滋生。2、使用時(shí)勿將各時(shí)段所應(yīng)用的溶液濃度弄錯(cuò)。3、上樣時(shí)，滴管應(yīng)沿柱上端內(nèi)壁加入樣品，動(dòng)作應(yīng)輕、慢，勿將柱床沖起。流洗平衡時(shí)亦應(yīng)如此。4、洗脫時(shí)應(yīng)注意及時(shí)收集樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰溶液流失，并注意層析柱不要流干，進(jìn)入空氣。5、切勿將檢測蛋白質(zhì)的磺基水楊酸與檢查SO的BaCl混淆，因二者與相應(yīng)物質(zhì)生成的沉2-42淀均為白色。6、葡聚糖凝膠價(jià)錢昂貴，要回收再生,避免損耗，嚴(yán)禁倒掉!濃度；實(shí)驗(yàn)時(shí)間、操作要點(diǎn)中的技巧、失誤等，以便總結(jié)實(shí)驗(yàn)時(shí)進(jìn)行核對和作為查找成敗原因XX分（滿分20】主要實(shí)驗(yàn)條件：10.3mol/LpH6.5NHAC）緩沖液：稱取NHAC23.12g，加蒸餾水800ml溶解，滴入稀44pH至6.5后，補(bǔ)加蒸餾水至1000ml。2、0.06mol/LpH6.5NHAC緩沖液：取上液用蒸餾水做5倍稀釋。43、0.02mol/LpH6.5NHAC緩沖液：取上液用蒸餾水做3倍稀釋。44、1.5mol/LNaCl-0.3mol/LNHAC溶液：稱取NaCl87.7g溶于0.3mol/LpH6.5NHAC溶液中至441000ml。5、飽和硫酸銨溶液：稱取固體(NH)SO850g加入1000ml蒸餾水中，在70-80℃下攪拌促溶，424室溫中放置過夜，瓶底析出白色結(jié)晶，上清液即為飽和硫酸溶液。實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：飽和硫酸銨加入到血清后有沉淀生成，沉淀呈米黃色，上清液呈淡黃色。原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：將3條經(jīng)染色的醋酸纖維素薄膜并列，使點(diǎn)樣線位于同一水平，以正常血清蛋白圖譜為對照，觀察提純的物質(zhì)屬哪種蛋白。所得的照片如下圖：血清清蛋白、γ-球蛋白純度鑒定的電泳圖譜觀察現(xiàn)象）和數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、歸納、分析、對比，盡量用圖表的形式概括實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；②討論：不應(yīng)是實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重述，而是以結(jié)果為基礎(chǔ)的邏輯推論。③結(jié)論：簡單扼要，說明本次實(shí)驗(yàn)所45XX】結(jié)果：從電泳圖譜中可以看出，清蛋白第一管和清蛋白第二管的蛋白質(zhì)與血清的清蛋白電泳圖譜幾乎一致，可以確定管內(nèi)的蛋白質(zhì)為清蛋白，同理球蛋白管內(nèi)的蛋白質(zhì)為γ-球蛋白。12-球蛋白管中的γ-球蛋白純度較低，導(dǎo)致最終的電泳圖譜與血清的電泳圖譜有略微偏差。結(jié)論：本次試驗(yàn)所獲得的結(jié)果基本與預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果相一致。思考題：1.硫酸銨鹽析一步,為什么是0.8ml血清加0.8ml飽和硫酸銨?答：因?yàn)榍宓鞍缀颓虻鞍椎柠}析濃度不一樣，使用半飽和硫酸銨溶液可以使球蛋白沉淀而清蛋白不沉淀，0.8ml血清和0.8ml飽和硫酸銨混合可以形成半飽和硫酸銨溶液從而達(dá)到分離的目的。2.為什么實(shí)驗(yàn)中DEAE纖維素柱分離γ-球蛋白后不用再生,可直接用于純化清蛋白?答：因?yàn)榫彌_液都一樣并且分離