發(fā)酵液的預處理和固液分離方法

關于發(fā)酵液的預處理和固液分離方法第1頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

預處理和固液分離的目的：

1、分離細胞、菌體和其它懸浮顆粒(細胞碎片、核酸和蛋白質的沉淀物)。2、除去部分可溶性雜質。3、改變?yōu)V液的性質（降低粘度等），以利于后繼操作。第2頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月總策略：

1、胞外產(chǎn)物：應盡可能轉移到液相中，常用調(diào)pH至酸性或堿性的方法來達到。2、胞內(nèi)產(chǎn)物：首先收集細胞、破壁，生化物質釋放到液相，再分離細胞碎片。3、通常，以含生化物質的液相為出發(fā)點，進行后繼操作。第3頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月一、發(fā)酵液的預處理

1、改變液體物理性質，促進固液分離。

細菌及某些放線菌菌體細小，發(fā)酵液粘度大，不能直接過濾，由于菌體自溶，核酸、蛋白質及其它有機粘性物質的存在會造成濾液渾濁，濾速極慢，因此，在預處理中應采用絮凝或凝聚的方法，設法增大懸浮報中固體粒子的大小，提高其沉降速度，或采用稀釋、加熱等方法降低粘度，以利于過濾。必要性：第4頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

2、發(fā)酵液雜質很多，其中影響最大的是高價無機離子和雜蛋白，預處理時，應盡量除去。

高價無機離子危害：在采用離子交換法提煉時，影響樹脂的交換容量。第5頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月雜蛋白質的危害：離子交換法和大網(wǎng)格樹脂吸附法提煉時，會降低吸附能力，萃取時，易產(chǎn)生乳化。過濾或膜過濾時，使濾速下降，膜受到污染。第6頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)、高價無機離子的去除方法宜加入草酸。草酸溶解度小，用量大時，可用其鹽，如草酸鈉。

草酸鈣能促使蛋白質凝固，提高濾液質量。草酸的回收：四環(huán)類抗生素廢液中，加入硫酸鉛，在60℃下生成草酸鉛。后者在90-95℃下用硫酸分解經(jīng)過濾、冷卻、結晶后可回收草酸。1、去除鈣離子：第7頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月2、除去鎂離子：加入三聚磷酸鈉，它和鎂離子形成可溶性絡合物：

用磷酸鹽處理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。此法可用于環(huán)絲氨酸的提煉。第8頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月3、除去鐵離子：

可加入黃血鹽，使形成普魯士藍沉淀。第9頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）、雜蛋白的去除方法蛋白質等電點多在pH4.0一5.5，此時溶解度最小。但單靠等電點法不能將大部分蛋白質除去。在酸性溶液中，蛋白質能與一些陰離子如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、蹂酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀。在堿性溶液，蛋白質能與一些陽離子，如Ag1+，Cu2+，Zn2+，F(xiàn)e3+和Pb2+等形成沉淀。等電點法：第10頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月變性蛋白質溶解度較小。最常用方法是加熱。加熱還能使液體粘度降低，加快過濾速度。但熱處理常對原液質量有影響，特別是會使色素增多。只適于熱穩(wěn)定的物質。熱變性法：第11頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月應用舉例：1、鏈霉素發(fā)酵液，調(diào)至酸性(pH3.0)，加熱至70℃，維持l／2h，能去除蛋白質，使過濾速度增大10一100倍，濾液粘度可降低1/6。2、檸檬酸發(fā)酵液，加熱至80C℃以上，使蛋白質變性凝固，降低發(fā)酵液鉆度，大大提高過濾速度。第12頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

大幅度改變pH，加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑等。

在抗生素生產(chǎn)中，常將發(fā)酵液pH調(diào)至偏酸性范圍(pH2—3)或較堿性范圍(pH8—9）使蛋白質凝固，一般以酸性下除去的蛋白質較多。加有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。使蛋白質變性的其它辦法：第13頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

舉例：1、四環(huán)類抗生素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白質，取得很好的效果。2、枯草桿菌發(fā)酵液，常加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，生成龐大的凝膠，把蛋白質、菌體及不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，從而加快了過濾速度。利用吸附作用除去蛋白質：第14頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）、凝聚和絮凝技術

凝聚：在中性鹽作用下，由于雙電層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。

絮凝：指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團的過程，是一種以物理的集合為主的過程。

基本概念：第15頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月凝聚和絮凝技術能有效地改變細胞、菌體和蛋白質等膠體粒子的分散狀態(tài)，使聚集起來，增大體積，以便于過濾。

常用于菌體細小而且粘度大的發(fā)酵液的預處理。第16頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月菌體或蛋白質等膠體粒子表面一般都帶有電荷，帶電原因主要是吸附溶液中的離子或自身基團的電離。通常菌體帶負電荷，由于靜電作用使帶正電荷的粒子被吸附在周圍，在界面上形成了雙電層。但這些正離子還受到熱運動的影響，具有離開膠粒表面的趨勢，在相距膠核表面約一個離子半徑的stern平面以內(nèi)，正離子被緊密柬縛在膠核表面，稱為吸附層或緊密層，在stern平面以外，剩余的正離子則在溶液中擴散開去，距離越遠，濃度越小，最后達到主體溶液的平均濃度，稱為擴散層。雙電層理論：1、凝聚技術第17頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月第18頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

當膠粒在溶液中作相對運動時，總有一薄層液體，隨著它一起滑移，這一薄層，厚度比吸附層稍大，滑移面(剪切面)在圖14—1中用波紋線表示。第19頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月雙電層結構的電位：第20頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月第21頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月1、擴散雙電層的結構：一旦由于布朗(Brown)運動使粒子間距離縮小到它們的擴散層部分重疊時，即產(chǎn)生電排斥作用，阻止了粒子的聚集。ζ電位越大，電排斥作用就越強，膠粒的分散程度也越大。2、水化層：由于膠粒表面的水化作用，形成了水化層，也能阻礙直接聚集。水化膜主要是伴隨膠粒帶電而引起，一旦ζ電位降低或消失，水化層也會隨之減弱或消失。膠粒保持分散狀態(tài)的原因第22頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月ζ電位數(shù)學表達式：第23頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月ζ電位與擴散層厚度和電動電荷密度成正比，而擴散層厚度又與溶液中離子強度有關，因此，對帶負電性菌體的發(fā)酵液，高價陽離子的存在，可壓縮擴散層厚度，促使ζ電位迅速降低，而且，化合價越高這種影響越顯著，當雙電層的排斥力不足以抗衡膠粒間的范德華引力時，由于熱運動的結果導致膠粒的互相碰撞而聚集起來。

由式(14—1，2)知：第24頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月電解質的凝聚能力可用凝聚價或凝聚值來表示。

使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質濃度(毫摩爾／升)，稱為凝聚價或凝聚值。反離子的價數(shù)越高，該值就越小，即凝聚能力越強。陽離子對帶負電荷的膠粒凝聚能力的次序：常用的凝聚劑電解質有：凝聚價或凝聚值：第25頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

有機高分子聚合物絮凝劑具有長鏈線狀結構，是水溶性聚合物，分子量高達數(shù)萬至一千萬以上，在長的鏈節(jié)上含有相當多的活性功能團，可以帶有多價電荷，也可以不帶電性。它們通過靜電引力、范德華分子引力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒的表面，一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同顆粒的表面上，產(chǎn)生架橋聯(lián)接，生成粗大的絮團，這就是絮凝作用。2、絮凝作用第26頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月第27頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月聚丙烯酰胺類衍生物聚苯乙烯類衍生物無機高分子聚合物絮凝劑，如聚合鋁鹽和聚合鐵鹽等。天然有機高分子絮凝劑：多聚糖類膠粘物，海藻酸鈉，明膠、骨膠、殼多糖和脫乙酰殼多糖等。絮凝劑第28頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)活性基團在水中解離情況不同，可分為非離子型、陰離子型(含有羧基)和陽離子型(含有胺基)三類。

優(yōu)點：用量少，—般以ppm計，絮凝體粗大，分離效果好，絮凝速度快、種類多，適用范圍廣。

缺點：存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，因此，當用于食品及醫(yī)藥工業(yè)時，應謹慎使用，要考慮這些物質最終能否從產(chǎn)品中去除。近年來還發(fā)展了聚丙烯酸類陰離子聚凝劑，它們無毒，可用于食品和醫(yī)藥工業(yè)中。聚丙烯酰胺類絮凝劑：第29頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

陽離子型高分子絮凝劑對帶負電菌體或蛋白質來說，同時具有降低粒子排斥電位和產(chǎn)生吸附架橋的雙重機理，所以可以單獨使用，

非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，主要通過分子間引力和氫鍵產(chǎn)生吸附架橋，常與無機電解質凝聚劑搭配使用。

首先加入無機電解質，使懸浮粒子脫穩(wěn)而凝聚，然后，再加入絮凝劑。凝聚作用為絮凝劑的架橋創(chuàng)造了良好的條件，從而，提高了絮凝效果。這種包括凝聚和絮凝機理的過程，常稱為混凝。混凝：第30頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

絮凝劑濃度絮凝劑分子量絮凝劑類型溶液的pH攪拌速度和時間助凝劑影響絮凝效果的因素：第31頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月A.絮凝劑濃度濃度增加有助于架橋充分，但是過多的加量會引起吸附飽和，在膠粒上形成覆蓋層而產(chǎn)生再次穩(wěn)定現(xiàn)象。第32頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

分子量提高、鏈增長，可使架橋效果明顯，但分子量不能超過一定的限度，因為隨分子量提高，高分子絮凝劑的水溶性降低，因此，分子量的選擇應適當，B.

高分子絮凝劑分子量第33頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月C.溶液pH的變化會影響絮凝劑功能團的電離度，從而影響分子鏈的伸展形態(tài)。

電離度增大，鏈節(jié)上相鄰離子基團間的電排斥作用，使分子鏈從卷曲狀態(tài)變?yōu)樯煺範顟B(tài)，架橋能力提高。第34頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月二、發(fā)酵液的過濾發(fā)酵液中含有大量菌體、細胞或細胞碎片以及殘余的固體培養(yǎng)基成分，過濾就是將懸浮在發(fā)酵液中的固體顆粒與液體進行分離的過程。在過濾操作中，要求濾速快，濾液澄清，并且有高的收率，但發(fā)酵液往往很難過濾，目前生產(chǎn)中還是一個薄弱環(huán)節(jié)。第35頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

（一）、發(fā)酵液的過濾特性和濾餅的重量比阻

發(fā)酵液大多數(shù)屬于非牛頓型液體，濾渣為可壓縮性的。衡量過濾特性的主要指標是濾餅的重量比阻rB，表示單位濾餅厚度的阻力系數(shù)，與濾餅的結構特性有關。第36頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

對于不可壓縮性濾餅，比阻值為常數(shù)，但對于可壓縮性濾餅，rB是操作壓力差的函數(shù)、一般可用下式表示：

由此可見濾餅的比阻值是隨操作壓力差的提高而增大的。因此開始過濾時應注意不能很快提高壓差，通?？恳褐淖匀粔翰钸M料，并應緩慢地逐步地升高壓力，一般在相當長的時間內(nèi)，壓力差不要超過0.05MPa，最后的壓差(不包括榨濾)也不超過0.3一0.4MPa。第37頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月恒壓下，可壓縮性濾餅的比阻值應為常數(shù)。如過濾介質的阻力相對較小可以忽略不計，則恒壓下的過濾方程式如下：第38頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月第39頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）、影響過濾速度的因素

菌種發(fā)酵條件(培養(yǎng)基的組成，未用完培養(yǎng)基的數(shù)量，消沫油，發(fā)酵周期)。過濾條件：壓力等第40頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

菌種對過濾速度影響很大。

真菌：菌絲粗大，容易過濾，不需特殊處理。濾渣呈緊密餅狀物，易從濾布上刮下，可采用鼓式真空過濾機過濾。

放線菌：菌絲細而分枝，交織成網(wǎng)絡狀，還含有很多多糖類物質，粘性強，重量比阻rB值高，過濾困難，一般需經(jīng)預處理，以凝固蛋白質等膠體。

細菌：菌體更細小，過濾十分困難，如不用絮凝等方法預處理發(fā)酵液，往往難以采用常規(guī)過濾的設備來完成過濾操作。1、菌種第41頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)基的組成對過濾速度影響也很大。黃豆粉、花生餅作氮源、淀粉作碳源會使過濾困難。

舉例：a、在鏈霉素發(fā)酵液的培養(yǎng)基中，加以黃豆粉代替玉米漿，則比阻值增大0.6—1.0倍。

b、

在青霉素發(fā)酵的培養(yǎng)基中，加入酵母蛋白，rB值也提高很多。此外，發(fā)酵后期加消沫油或剩余大量末用完的培養(yǎng)基都會使過濾困難。2、培養(yǎng)基第42頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月第43頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月第44頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

正確選擇發(fā)酵終了時間對過濾影響很大。在菌絲自溶前必須放罐，因為細胞自溶后的分解產(chǎn)物很難過濾。有時延長發(fā)酵周期雖能使發(fā)酵單位有所提高，但嚴重影響發(fā)酵液質量，使色素和膠狀雜質增多、過濾困難，最終造成成品質量降低。3、發(fā)酵時間第45頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）、改善過濾性能的方法對于難過濾的發(fā)酵液，必須設法改善過濾性能、降低濾餅的比阻值，以提高過濾速度。

改善過濾性能的方法：1、預處理發(fā)酵液。等電點，蛋白質變性、吸附以及凝聚和絮凝等方法。2、加入助濾劑，直接在發(fā)酵液中形成填充一凝固劑。

3、酶解作用第46頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，能使濾餅疏松，濾速增大。

常用的助濾劑：硅酸鹽粉末(硅藻土）、紙漿、珠光石(即珍珠巖，成分為二氧化硅）。

要求：助濾劑必須不吸附或很少吸附生化物質。1、加入助濾劑第47頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

加入方式：

1、在濾布上預先鋪一層助濾劑(1—2mm)，采用此種方法，會使濾速降低，但濾液透明度很快增加。2、直接加入發(fā)酵液中。助濾劑用量若等于懸浮液中固體含量時，濾速最快。第48頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月反應劑相互作用，或和溶解性鹽發(fā)生反應，生成沉淀。能防止菌絲體粘結，使菌絲具有塊狀結構。沉淀本身即可作為助濾劑，并且還能使膠狀物和懸浮物凝固。正確選擇反應劑和反應條件，能使過濾速度提高3—10倍。2、加入反應劑第49頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月舉例：新生霉素發(fā)酵液中加入氯化鈣和磷酸鈉，生成的磷酸鈣可作為填充——凝固劑。一方面作為助濾劑，另一方面還可使某些蛋白質凝固。環(huán)絲氨酸發(fā)酵液用氧化鈣和磷酸處理，生成的磷酸鈣沉淀，熊使懸浮物凝固。多余的磷酸根離子，還能除去鈣、鎂離子。第50頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

如果發(fā)酵液中有不溶解的多糖存在，則最好用酶將它轉化為單糖，以提高過濾速度。

例如：萬古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，加入淀粉酶后，能使過濾速度加快。3、采用酶制劑分解黏性物質第51頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

發(fā)酵液染菌后，會含很多細菌菌體，雜質也增多，造成過濾困難。雜菌的種類不同，對過濾的影響也不同。一般染霉菌尚可，染產(chǎn)氣桿菌則很難過濾。

處理方法：升高溫度、增加純化劑用量、加助濾劑等。

舉例：四環(huán)素染菌發(fā)酵液可以采用加溫至40一50℃，增加黃血鹽、硫酸鋅用量，以正常批號的濾渣作為助濾劑等辦法。4、染菌發(fā)酵液的處理方法第52頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）、固－液分離設備的選擇

不同性狀的發(fā)酵液應選擇不同的固—液分離設備。

常用分離設備：板框壓濾機，鼓式真空過濾機和心沉降分離機等。第53頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月1、板框壓濾機第54頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

優(yōu)點：過濾面積大，過濾推動力(壓力差)能較大幅度地進行調(diào)整，并能耐受較高的壓力差，故對不同過濾特性的發(fā)酵液適應性強，同時還具有結構簡單，價格低，動力消托少等優(yōu)點。缺點：不能連續(xù)操作，設備笨重，勞動強度大，衛(wèi)生條件差，非生產(chǎn)的輔助時間長(包括解框、卸餅、洗濾餅，洗濾布，重新壓緊板框等)，阻礙了過濾效率的提高。第55頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月

自動板框過濾機：是一種較新型的壓濾設備，板框的拆裝，濾渣的脫落卸出和濾布的清洗等操作都能自動進行，大大縮短了非生產(chǎn)的輔助時間和減輕了勞動強度。第56頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月對于菌體較細小、粘度較大的發(fā)酵液，可加入助濾劑或采用絮凝等方法預處理后進行壓濾。對于難過濾的枯草桿菌發(fā)酵液，可設計一種特別薄的濾框以減小濾餅的阻力。另外，也可采用帶有橡皮隔膜的壓濾機，過濾結束時，在濾板和橡皮膜之間通入壓縮空氣來壓札濾餅，將液體擠壓出來。常用技術措施第57頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月2、鼓式真空過濾機鼓式真空過濾機能連續(xù)操作，并能實現(xiàn)自動化控制，但是壓差較小，主要適用于霉菌發(fā)酵液的過濾。而對菌體較細或粘稠的發(fā)酵液不太適用。第58頁，課件共65頁，創(chuàng)作于2023年2月一種