微生物第七章1

第七章微生物的生長及其控制第一節(jié)微生物生長規(guī)律第二節(jié)影響微生物生長的環(huán)境因素第三節(jié)微生物生長的控制方法第一頁，共四十二頁。第一節(jié)微生物的生長規(guī)律7.1.1微生物的培養(yǎng)和群體生長7.1.2生物量測定方法7.1.3微生物的生長規(guī)律7.1.4生長參數(shù)和生長過程控制7.1.5維持穩(wěn)定生長的方法第二頁，共四十二頁。微生物的培養(yǎng)：在實(shí)驗(yàn)室或在工業(yè)上，使用培養(yǎng)基和培養(yǎng)容器，在特定培養(yǎng)工藝和培養(yǎng)條件下，人工培養(yǎng)微生物，獲得微生物菌體或代謝產(chǎn)物的過程；在培養(yǎng)過程中，微生物的個(gè)體生長表現(xiàn)為細(xì)胞組分的均衡增加，細(xì)胞形態(tài)略有增大；微生物的繁殖導(dǎo)致個(gè)體數(shù)量或生物量有規(guī)律的增長，表現(xiàn)為群體的生長；群體生長與培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基和環(huán)境因素）密切相關(guān)；7.1.1微生物培養(yǎng)和群體生長第三頁，共四十二頁。在人工培養(yǎng)條件下培養(yǎng)微生物，通過繁殖而得到的微生物群體稱為培養(yǎng)物（culture）；只有一種微生物的培養(yǎng)物，或者由單個(gè)細(xì)胞繁殖得到的微生物群體，稱為純培養(yǎng)物（pureculture），簡稱純培養(yǎng)；微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和工業(yè)發(fā)酵，一般都是純培養(yǎng)；微生物由于個(gè)體微小，很容易混雜，需要經(jīng)常性的進(jìn)行菌種純化，以獲得微生物的純培養(yǎng)；微生物的純培養(yǎng)第四頁，共四十二頁。平板單菌落分離法：使微生物的單細(xì)胞或單孢子充分分散，彼此分開，然后涂布在固體平面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后長出的單菌落，很可能是由一個(gè)細(xì)胞或孢子繁殖形成的純培養(yǎng)；平板劃線法分離法稀釋涂（倒）平板法顯微操縱器分離：借助顯微鏡和顯微操作工具，直接分離單細(xì)胞（單孢子），然后接種培養(yǎng)；純培養(yǎng)的分離方法第五頁，共四十二頁。用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液或菌苔，在平板上劃線；每畫一組平行線，灼燒接種環(huán)一次；反復(fù)劃線、可拉出單細(xì)胞；平板劃線法分離法第六頁，共四十二頁。

稀釋涂（倒）平板法將待分離材料制備成懸液，使細(xì)胞或孢子充分分散；用10倍稀釋法稀釋，取適當(dāng)濃度的稀釋液，涂布平板或與培養(yǎng)基混合后倒平板：涂平板加菌懸液0.2mL倒平板加菌懸液1mL第七頁，共四十二頁。微生物的培養(yǎng)方法根據(jù)培養(yǎng)基物理狀態(tài)和培養(yǎng)規(guī)模，好氧微生物培養(yǎng)方式分為：固體斜面培養(yǎng)、固體平板培養(yǎng)、茄子瓶培養(yǎng)、大規(guī)模固體發(fā)酵；半固體試管培養(yǎng)；搖管培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、小型發(fā)酵罐培養(yǎng)、大規(guī)模深層攪拌液體發(fā)酵；實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)厭氧菌需要驅(qū)除和隔絕氧氣；工業(yè)厭氧液體發(fā)酵；第八頁，共四十二頁。在微生物生理代謝基礎(chǔ)研究，或者微生物工程應(yīng)用中，大多使用發(fā)酵罐（生物反應(yīng)器）進(jìn)行液體培養(yǎng)；分批培養(yǎng)（batchculture）：指恒定體積的液體培養(yǎng)，從接種開始，直到培養(yǎng)結(jié)束，在培養(yǎng)過程中不補(bǔ)充營養(yǎng)，也不移出培養(yǎng)物；流加分批培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，不斷流加營養(yǎng)物，培養(yǎng)體積不斷增加；連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，不斷流加營養(yǎng)物，同時(shí)不斷移出培養(yǎng)物；發(fā)酵罐微生物液體培養(yǎng)方式第九頁，共四十二頁。微生物工業(yè)發(fā)酵過程發(fā)酵工程包含三個(gè)過程：上游技術(shù)（微生物遺傳育種技術(shù)）、微生物發(fā)酵過程和下游技術(shù)（分離工程）；微生物發(fā)酵過程包含同時(shí)進(jìn)行的微生物培養(yǎng)過程和微生物反應(yīng)過程；在工業(yè)微生物發(fā)酵過程中，既要控制微生物的生長，又要控制微生物的代謝；通常的微生物培養(yǎng)僅需要控制微生物的生長；控制微生物生長，必需了解微生物的生長規(guī)律，清楚影響生長的主要因素；第十頁，共四十二頁。青霉素G的發(fā)酵生產(chǎn)工藝——發(fā)酵（反應(yīng)）過程種子培養(yǎng)：產(chǎn)生健壯和大量的種子；產(chǎn)黃青霉接種到固體培養(yǎng)基上，在25℃下培養(yǎng)7天，收獲產(chǎn)黃青霉的孢子；將孢子洗脫下來，制備孢子懸液，接種到液體種子培養(yǎng)基中，在27℃下，種子罐通氣攪拌培養(yǎng)24h；發(fā)酵培養(yǎng)（微生物反應(yīng)）：獲得大量次級代謝產(chǎn)物；將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵罐中，在27℃下，通氣攪拌培養(yǎng)7天，期間流加苯乙酸，作為合成青霉素的前體物；第十一頁，共四十二頁。種子擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵的工藝流程和工藝條件工業(yè)發(fā)酵：通過控制微生物的培養(yǎng)條件，使微生物正常生長，并大量積累目標(biāo)代謝產(chǎn)物；平面培養(yǎng)一級種子罐培養(yǎng)搖管培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)二級種子罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)第十二頁，共四十二頁。7.1.2生物量測定方法微生物培養(yǎng)物的定量測定，稱為生物量測定；測定對象不同，方法不同，單位也不同，但可互相校正；顯微鏡直接計(jì)數(shù)法：測單細(xì)胞或單孢子；平板菌落計(jì)數(shù)法：測單細(xì)胞或單孢子；細(xì)胞濕重和干重法：測定單細(xì)胞或絲狀微生物；分光光度法：測單細(xì)胞或單孢子；生理指標(biāo)法：測定單細(xì)胞或絲狀微生物；第十三頁，共四十二頁。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法：是在顯微鏡下，用血球計(jì)數(shù)板對單細(xì)胞或單孢子直接計(jì)數(shù)，單位為：個(gè)數(shù)/mL；顯微鏡直接計(jì)數(shù)法不能區(qū)分死菌與活菌，稱為全菌計(jì)數(shù)法；第十四頁，共四十二頁。血球計(jì)數(shù)板是一塊特殊的載波片，在中間的兩個(gè)平臺上各刻有一個(gè)大方格網(wǎng)；大方格網(wǎng)由九個(gè)大方格組成，中間的正方形大方格為計(jì)數(shù)室；計(jì)數(shù)室邊長1mm、高0.1mm，體積0.1mm3

（10-4ml）血球計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)計(jì)數(shù)室平臺方格網(wǎng)方格網(wǎng)第十五頁，共四十二頁。計(jì)數(shù)室被劃分為25個(gè)中方格，每個(gè)中方格分為16個(gè)小方格，共400個(gè)小方格；上面蓋上蓋玻片；血球計(jì)數(shù)板的使用方法濃度約108個(gè)細(xì)胞/毫升的菌懸液，滴加在蓋玻片與血球計(jì)數(shù)板平臺的結(jié)合處，使菌懸液經(jīng)毛細(xì)作用吸入計(jì)數(shù)室，靜置，使細(xì)胞沉底；計(jì)數(shù)若干小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算每小格平均數(shù)，則：菌濃（個(gè)/ml）＝每格平均數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)第十六頁，共四十二頁。將待測菌懸液適當(dāng)稀釋后，涂布在平面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，一個(gè)菌落相當(dāng)于一個(gè)活細(xì)胞；平板菌落計(jì)數(shù)屬于活菌計(jì)數(shù)法，適用于單細(xì)胞或單孢子計(jì)數(shù)，單位：菌落形成單位/mL（cfu/mL）（colonyformingunit，cfu)平板菌落計(jì)數(shù)法選擇生長50～300個(gè)單菌落的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果準(zhǔn)確；第十七頁，共四十二頁。平板菌落計(jì)數(shù)方法10倍稀釋法制備待測菌懸液，選擇適當(dāng)?shù)南♂尪?，定量?.1~0.2mL）取稀釋液涂布平板，或者定量（1mL）取稀釋液與融化后冷卻至45℃的培養(yǎng)基混合倒平板；培養(yǎng)后，對長出的單菌落計(jì)數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)，得到原菌液的生物量：cfu/mL通常選擇三個(gè)稀釋度涂平板，擇其合適者計(jì)數(shù)；第十八頁，共四十二頁。單細(xì)胞或絲狀微生物的生物量均可用直接測量濕重或干重的方法測量；離心收集細(xì)胞沉淀，無菌水充分洗滌后，直接分析天平稱重—濕重（mg/ml）；洗滌后的細(xì)胞沉淀在105℃下烘干至恒重，分析天平稱重—干重（mg/ml）；培養(yǎng)液菌體濕重約40g/L，干重約4mg/mL；濕重受培養(yǎng)基成分影響大，而不準(zhǔn)確；干重法費(fèi)時(shí)，靈敏度低，適于測定絲狀微生物：細(xì)胞濕重和干重法第十九頁，共四十二頁。在一定范圍內(nèi)，菌懸液的菌體濃度與一定波長下的光密度值（opticaldensity,OD值）呈線性關(guān)系；用分光光度計(jì)，在600nm波長下，測定菌懸液的OD600值，或吸光度值（A600），可校正為1OD=n個(gè)細(xì)胞/mL；分光光度法OD值在0.2~0.8之間呈線性關(guān)系；適用于單細(xì)胞或單孢子懸液的生物量測定；第二十頁，共四十二頁。在不方便使用顯微計(jì)數(shù)、平板菌落計(jì)數(shù)、細(xì)胞濕重和干重測定、分光光度測定生物量的情況下，可測定與生物量成比例關(guān)系的細(xì)胞總蛋白量，總核酸量，或者呼吸強(qiáng)度，間接測定總生物量，稱為生理指標(biāo)法；測定總蛋白：凱氏定氮法測定測總核酸：定磷法測定測呼吸強(qiáng)度：CO2產(chǎn)生量（速率）生理指標(biāo)法第二十一頁，共四十二頁。生長規(guī)律：二分裂殖的單細(xì)胞微生物在分批培養(yǎng)過程中，其生物量的增長隨培養(yǎng)時(shí)間的變化規(guī)律：即生長過程表現(xiàn)出延遲期、指數(shù)生長期（對數(shù)期）、穩(wěn)定期、對數(shù)衰亡期（死亡期）的規(guī)律變化；非二分裂殖或非單細(xì)胞的微生物在分批培養(yǎng)過程中，生長規(guī)律類似，但不典型；一般通過繪制微生物培養(yǎng)過程的生長曲線，反映其生長規(guī)律和生長參數(shù)；7.1.3微生物的生長規(guī)律第二十二頁，共四十二頁。微生物的生長曲線生長曲線：在分批培養(yǎng)中，以微生物的生物量為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制的曲線圖，反映生物量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化；對于二分裂殖的單細(xì)胞微生物，用細(xì)胞數(shù)量的對數(shù)值為生長曲線的縱坐標(biāo)；對于其它微生物可用培養(yǎng)液的OD值或者細(xì)胞干重作為縱坐標(biāo)；第二十三頁，共四十二頁。在確定的液體培養(yǎng)條件下，接種后，每隔一定時(shí)間取樣，測定生物量，至培養(yǎng)結(jié)束；用生物量對培養(yǎng)時(shí)間作圖，得到某種微生物在特定條件下的生長曲線；生長曲線的繪制方法實(shí)線為活菌計(jì)數(shù)，虛線為總菌計(jì)數(shù)第二十四頁，共四十二頁。延遲期和指數(shù)生長期延遲期（lagphase）：培養(yǎng)的最初階段，生物量不隨培養(yǎng)時(shí)間增加；此階段，細(xì)胞繁殖速率很低，細(xì)胞處于吸收營養(yǎng)，調(diào)整代謝的生理階段；此階段，細(xì)胞繁殖速率最大且穩(wěn)定，細(xì)胞代謝旺盛生理狀態(tài)均一；對數(shù)期（logphase）或指數(shù)生長期（exponentialgrowthphase）：生物量隨培養(yǎng)時(shí)間呈指數(shù)曲線增長；第二十五頁，共四十二頁。穩(wěn)定期穩(wěn)定期（stationaryphase）：生物量保持穩(wěn)定，不隨培養(yǎng)時(shí)間變化，此階段，細(xì)胞繁殖速率與死亡速率相同，活細(xì)胞量處于動(dòng)態(tài)平衡；生長到穩(wěn)定期，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物消耗、代謝廢物積累、環(huán)境條件改變；部分細(xì)胞開始衰老、死亡和自溶裂解，細(xì)胞形態(tài)多樣、生理狀態(tài)不均一；第二十六頁，共四十二頁。衰亡期衰亡期或?qū)?shù)衰亡期（logarithmicdeclinephase）：活細(xì)胞數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間呈指數(shù)曲線下降，細(xì)胞幾乎停止繁殖，而死亡速率達(dá)到最大；此階段，營養(yǎng)物耗盡、有毒代謝物積累、環(huán)境惡化；多數(shù)細(xì)胞進(jìn)入衰老、死亡和自溶狀態(tài)，細(xì)胞多畸形，活細(xì)胞數(shù)量降低；第二十七頁，共四十二頁。7.1.4生長參數(shù)和生長過程控制描述生長過程的參數(shù)：延遲期的長短；指數(shù)期的代時(shí)和最大比生長速率；穩(wěn)定期的長短、最大生物量和生長得率；可通過一定方式控制這些參數(shù)而控制生長過程；第二十八頁，共四十二頁。延遲期是休眠細(xì)胞的活化期，或者是細(xì)胞代謝系統(tǒng)與營養(yǎng)和環(huán)境條件的適應(yīng)期；在工業(yè)發(fā)酵中有必要采取措施縮短延遲期，而縮短發(fā)酵周期：使用活化的新鮮培養(yǎng)物作為菌種；使用營養(yǎng)豐富的天然培養(yǎng)基，或速效碳、氮源；使種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)成分相近；增大接種量，縮短延遲期；延遲期長短的控制第二十九頁，共四十二頁。指數(shù)期是細(xì)胞以穩(wěn)定（最大）速率繁殖的階段，繁殖速率可用代時(shí)或倍增時(shí)間表征；代時(shí)（generationtime，G）：二分裂殖的單細(xì)胞微生物在指數(shù)期繁殖一代（分裂一次）所需要的時(shí)間；倍增時(shí)間（doubletime，D）：非二分裂殖或絲狀微生物在指數(shù)期生物量增加一倍所需時(shí)間；代時(shí)或倍增時(shí)間越短，表明微生物的生長（繁殖）速率越快；代時(shí)或倍增時(shí)間與培養(yǎng)條件相關(guān)；指數(shù)期的代時(shí)或倍增時(shí)間

(G)第三十頁，共四十二頁。代時(shí)和倍增時(shí)間的測定方法二分裂殖單細(xì)胞微生物的生長曲線縱坐標(biāo)上選擇指數(shù)期內(nèi)細(xì)胞數(shù)量為倍數(shù)關(guān)系的兩點(diǎn)，其對應(yīng)橫坐標(biāo)兩點(diǎn)之差為代時(shí)；非二分裂殖火絲狀微生物在生長曲線縱坐標(biāo)上取生物量為倍數(shù)關(guān)系的兩點(diǎn)對應(yīng)的時(shí)間差為倍增時(shí)間；第三十一頁，共四十二頁。N0

：初始細(xì)胞量；Nt

：t時(shí)間的細(xì)胞量;n：從0~t時(shí)間內(nèi)繁殖的代數(shù)二分裂殖單細(xì)胞微生物代時(shí)的計(jì)算公式G=————tt–t0tt–t0n=————————3.322(logNt－logN0)第三十二頁，共四十二頁。微生物在確定培養(yǎng)條件下的代時(shí)（倍增時(shí)間）Vibrionatriegens柱胞魚腥藻桃褐腐病菌巢狀組囊藻第三十三頁，共四十二頁。

比生長速率（m）：在確定培養(yǎng)條件下，在微生物指數(shù)生長期，單位生物量單位時(shí)間內(nèi)的增加量為常數(shù)，或細(xì)胞瞬時(shí)增長量與此時(shí)細(xì)胞量的比值是一個(gè)常數(shù)，表征各種微生物的生長速率：dN/dt＝mN（m的單位：mg/mg·h＝h-）lnNt-lnN0＝m(tt－t0)logNt-logN0＝m(tt－t0)/2.303μ＝(logNt－logN0)×2.303/(tt－t0)比生長速率（m）的計(jì)算第三十四頁，共四十二頁?！逩=（tt-t0）／3.322（logNt－logN0）

m＝（logNt－logN0）×2.303/（tt－t0）∴G＝2.303／3.322mG＝0.693／m在指數(shù)生長期，比生長速率達(dá)到最大且穩(wěn)定；代時(shí)（倍增時(shí)間）最短且穩(wěn)定；某種微生物的比生長速率或代時(shí)，決定于生長的營養(yǎng)和環(huán)境條件，是可以控制的；代時(shí)或倍增時(shí)間與比生長速率的換算關(guān)系第三十五頁，共四十二頁。穩(wěn)定期持續(xù)時(shí)間的延長生長到達(dá)穩(wěn)定期后，營養(yǎng)物質(zhì)濃度降低程度、有毒代謝廢物的積累量、環(huán)境惡化程度決定穩(wěn)定期的長短；在發(fā)酵工業(yè)中，生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物需要盡量延長穩(wěn)定期，以便達(dá)到最高發(fā)酵單位；一般采用補(bǔ)充營養(yǎng)物，移出部分代謝產(chǎn)物的半連續(xù)或連續(xù)發(fā)酵方式，以及控制pH值，提高通氣量等方式延長穩(wěn)定期；第三十六頁，共四十二頁。培養(yǎng)到穩(wěn)定期時(shí)達(dá)到了最大生物量，以濕重或干重g/L表征；影響最大生物量的主要因素是培養(yǎng)基中營養(yǎng)物的濃度；生物量（g）碳源消耗量（g、mol）Y＝穩(wěn)定期的最大生物量和生長得率生長得率（Y）：消耗單位量的營養(yǎng)物質(zhì)（碳源）所獲得的生物量；好氧菌一般Y值約為0.20～0.50；第三十七頁，共四十二頁。限制性營養(yǎng)物濃度與m和最大生物量的關(guān)系限制性營養(yǎng)物：生長必需的某種營養(yǎng)物（碳源、氮源、生長）在培養(yǎng)基中限量提供，也稱為生長限制性因子；限制性營養(yǎng)物濃度與最大生長量呈線性關(guān)系；與比生長速率呈雙曲線關(guān)系；第三十八頁，共四十二頁。在工業(yè)