顯微鏡的七種觀察方法

關(guān)于顯微鏡的七種觀察方法第1頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月顯微鏡的七種觀察方法第2頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月按觀察方法分七種明場暗場熒光偏光相差DIC霍夫曼第3頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月顯微觀察方式第4頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月按觀察方法分7-11.明場:照明光直接通過聚光鏡入射于試樣，并透過試樣后進入物鏡并最終被觀察到。第5頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月明場第6頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月明場觀察方式常規(guī)觀察方式應(yīng)用領(lǐng)域： 常規(guī)鏡檢、病理、染色標本優(yōu)點： 視野亮度高、均勻， 應(yīng)用范圍廣， 操作簡單，價格低， 物鏡適用于熒光觀察缺點： 透明標本對比度低， 標本沒有立體感第7頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月按觀察方法分7-22.暗場:照明光通過物鏡外圍射于試樣，來自試樣的干涉及衍射光進入物鏡并最終被觀察到。第8頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月暗場第9頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1原理丁道爾(Tyndall)現(xiàn)象，微粒對斜射光反射或衍射，增大了人眼可見性。2特點觀察到極其微小物體，分辨率可達0.02~0.004um(明場0.4um)—”超顯微“。3缺點只能觀察到物體存在、運動和外部形態(tài)不方便調(diào)節(jié)標本要求高（灰塵、蓋片、載片）第10頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月4應(yīng)用：

微小粒子、細菌形態(tài)觀察、細菌記數(shù)，透明標本觀察等第11頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月按觀察方法分7-33.熒光:利用某些物質(zhì)在受到了紫外光或短波長的光激發(fā)照射以后能夠發(fā)射出比激發(fā)光波長長的熒光的特性的觀察方法第12頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光第13頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月什么是熒光?

物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。顯微鏡熒光利用光源激發(fā)——光化熒光第14頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

熒光的種類

自發(fā)（固有）熒光

二次熒光第15頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光的性質(zhì)吸收光，必需有激發(fā)光源熒光波長＞激發(fā)波長（損失熱能）熒光強度極小于激發(fā)光的強度有不同程度的衰減熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒光效率第16頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光顯微鏡的優(yōu)點和用途優(yōu)點：檢出能力高（放大作用）對細胞的刺激?。梢曰铙w染色）能進行多重染色用途：物體構(gòu)造的觀察——熒光素熒光的有無、色調(diào)比較進行物質(zhì)判別——抗體熒光等發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析第17頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

熒光顯微鏡的種類

透射式第18頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光顯微鏡的種類

落射式第19頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光顯微鏡的主要部件

透射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡吸收濾色鏡暗場聚光鏡

落射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡第20頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月落射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡第21頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月落射熒光顯微鏡的構(gòu)造第22頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光顯微鏡光源

汞燈光源:提供激發(fā)光(U、V、B、G)

氙燈光源：高峰值更寬，更穩(wěn)定第23頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光顯微鏡激發(fā)透鏡組

激發(fā)濾色鏡:

激發(fā)波長選擇

激發(fā)透鏡組（激發(fā)塊）:

T%nmBANDPASS入射光發(fā)射光激發(fā)濾色鏡分光濾色鏡吸收濾色鏡第24頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月落射熒光顯微鏡各部件特性和作用

吸收濾色鏡:熒光透過,阻擋雜光

分色鏡:反射激發(fā)光,熒光透過＞A透過A＜A反射B＞B透過＜B阻擋nmnmT%T%A第25頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月落射熒光顯微鏡各部件特性和作用

吸收濾色鏡:熒光透過,阻擋雜光

分色鏡:反射激發(fā)光,熒光透過＞A透過A＜A反射B＞B，＜C透過nmnmT%T%AC第26頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月濾色鏡的選擇熒光素的特性濾色鏡的特性激發(fā)分色吸收第27頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月帶寬對圖象的影響SWB:BP420-480WB:BP450-480WIB:BP460-490NB:BP470-490FITC+PI第28頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月多重染色標本的多色觀察FITC+TexasRed+DAPI第29頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月三色濾色鏡的特性曲線激發(fā)分色吸收第30頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月雙重染色標本的單色和雙色觀察

WU

WIBDUAL

BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI第31頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月單色濾色鏡的特性曲線第32頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月雙色濾色鏡的特性曲線第33頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)行顯微鏡特點和各種濾色鏡第34頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月自由組合激發(fā)塊吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡第35頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月油鏡應(yīng)使用熒光油第36頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

物鏡光欄的運用光欄全開啟光欄適當關(guān)小減少雜散光干擾第37頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光的衰減

防衰減的方法使用抗衰減劑選擇衰減小的熒光素降低激發(fā)光強度降低標本中氧的濃度有衰減的標本第38頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月使用抗衰減劑的效果第39頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月汞燈燈箱構(gòu)造燈室，上下、左右旋鈕，聚光鏡旋鈕第40頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月按觀察方法分7-44.偏光:有些物質(zhì)在兩個呈一定夾角的偏光濾片之間可現(xiàn)呈鮮明的對比，或根據(jù)雙折射性能和定向呈現(xiàn)顏色第41頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月偏光第42頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1原理依據(jù)波動光學(xué)原理觀察和精密測定標本細節(jié),或透明物體改變光束的物理參數(shù),以此判別物質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種顯微鏡自然光（多振動面）偏振器1偏振器2偏振光（單一振動面）各向同性：單折射體，光性質(zhì)不因照射方向而改變，普通氣體、液體、非結(jié)晶固體等各向異性：雙折射體，光速度、折射率、吸收和振動面、振幅隨照射方向不同，晶體、纖維等第43頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)用：

礦物質(zhì)、化學(xué)物品鑒別鑒別纖維、染色體、淀粉粒、細胞中晶體植物病理檢驗鑒別骨骼、牙齒、膽固醇、神經(jīng)纖維、腫瘤細胞、橫紋肌和毛發(fā)等第44頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月偏光顯微鏡主要用于檢測礦石,地質(zhì)大學(xué)會用到,特別是可以用來鑒定珠寶,另外可以檢測生物內(nèi)骨骼,這個我還沒有遇見實例,還可以檢測生物化學(xué)結(jié)晶,化學(xué)院用來觀察結(jié)晶液像,其他在紡織物品化學(xué)成分上檢測上,物理芯片上等,凡是觀察雙折射晶體會使用偏光顯微鏡。第45頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月按觀察方法分7-55.相襯（差）:利用光線通過分別處于聚光鏡與物鏡的一對互補的光環(huán)后產(chǎn)生干涉（強度疊加或減弱），即相位差轉(zhuǎn)變成了光強差，從而可清楚觀察到使原來不易看清的透明類樣品（即相位物體，如活細胞）。第46頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月相差（襯）第47頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月相差（襯）第48頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1原理利用被檢物體的光程（折射率x厚度）差進行鏡檢，即利用干涉現(xiàn)象，將相位差變?yōu)槿搜劭梢苑直娴恼穹罟曹椕妫何展饩€，直射光通過補償面：相位推遲，衍射光通過物鏡相板

聚光鏡環(huán)狀光闌第49頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月2特點鑒定活體細胞最實用、最經(jīng)濟的方法3缺點需要光強高切片不能太厚(5~10um)蓋片、載片需符合標準最好配用單色濾光鏡操作較麻煩熒光效果不如明場物鏡第50頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月4應(yīng)用：

無色透明活體標本的細微結(jié)構(gòu)，檢查,鑒定活體細胞(培養(yǎng)細胞,分離細胞)第51頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月按觀察方法分7-66.DIC:照明光由微分干涉對比棱鏡變?yōu)閮墒苌涔?，并使樣品高度差異造成在光路上的微小差異，而光路差異變?yōu)槔梦⒎指缮鎸Ρ壤忡R和檢偏振器的明暗對比。有時也利用敏感色板（波長補償片），加強了高度差異的顏色變化。第52頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月DIC相襯DIC微分干涉相襯第53頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1原理通過特制的棱鏡將偏振光分解相互垂直，強度相等的光束，光束載極近的兩點（小于顯微鏡的分辨率）上通過被檢物體，從而在相位上略有差別，使圖象呈現(xiàn)出立體三維感覺。第54頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月2特點可以使被檢物體產(chǎn)生三維立體感覺觀察效果更直觀無須特殊物鏡，與熒光觀察配合更好可以調(diào)節(jié)背景和物體的顏色變化而達到理想的效果。第55頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月3缺點需要光強高，雙折射物質(zhì)不能達到DIC鏡檢效果，不能應(yīng)用于塑料容器培養(yǎng)物的觀察，鏡檢靈敏度有方向性，調(diào)節(jié)較復(fù)雜第56頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月4應(yīng)用：

無色透明活體標本的細微結(jié)構(gòu)，無色熒光標本，染色標本，顯微操作等第57頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月按觀察方法分7-77.霍夫曼:光線穿過設(shè)于聚光鏡內(nèi)的狹縫光闌后并經(jīng)“相位物體”（透明體）折射，再經(jīng)過專用物鏡內(nèi)的具有暗、灰、明三個區(qū)的一塊濾光片，而最終使光線按折射角的不同呈明暗的變化，其所成的像也類似DIC那樣具有浮雕效果。第58頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月霍夫曼第59頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1原理斜射光照射到標本產(chǎn)生折射、衍射，光線通過物鏡光密度梯度調(diào)節(jié)器產(chǎn)生不同陰影，從而使透明標本表面產(chǎn)生明暗差異，增加觀察對比度。第60頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月2.歷史1975年，RobertHoffman博士發(fā)明2002年，專利到期，各顯微鏡廠家紛紛推出采用以自己名義命名的RC技術(shù)產(chǎn)品3.特點提高未染色標本的可見性和對比度；圖象顯示陰影或近似三維結(jié)構(gòu)而不會產(chǎn)生光暈；可檢測雙折射物質(zhì)(巖石切片、水晶、骨頭)；可檢測玻璃,塑料等培養(yǎng)皿中的細胞