細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

中藥制劑分析技術(shù)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法ShandongCollegeofTraditionalChineseMedicine一、基本概念1.細(xì)菌內(nèi)毒素（Endotoxin）是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分，由脂多糖組成。

2.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法系指利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU)表示。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法二、檢查方法包括凝膠法和光度測(cè)定法凝膠法系通過(guò)鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來(lái)檢測(cè)或半定量?jī)?nèi)毒素的方法。是中國(guó)藥典的“仲裁”方法。光度測(cè)定法后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法，系分別利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中的濁度變化及產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少來(lái)定量測(cè)定內(nèi)毒素。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法三、儀器和試劑（一）儀器和試劑

37±1℃恒溫水浴或適宜的恒溫器具、超凈工作臺(tái)、漩渦混合器、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、加樣器、鱟試劑、鱟試驗(yàn)用水、pH調(diào)節(jié)劑等。鱟試劑漩渦混合器加樣器器具要求：凡與供試品或試劑直接接觸的器具必須經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250℃、30分鐘以上)去除，也可采用其他適宜方法。（二）儀器和試劑的相關(guān)要求鱟試驗(yàn)用水：凝膠法：內(nèi)毒素含量小于0.015EU／ml光度測(cè)定法：內(nèi)毒素含量小于0.005EU/ml，且對(duì)內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)干擾作用的滅菌注射用水。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品：系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)。內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：系以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于試驗(yàn)中的鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及各種陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法三、測(cè)定方法供試品確定限值確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）供試品干擾實(shí)驗(yàn)正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷檢驗(yàn)流程細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法供試品內(nèi)毒素檢查：凝膠限度試驗(yàn)編號(hào)內(nèi)毒素濃度／被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無(wú)／供試品溶液2B2λ／供試品溶液2C2λ／檢查用水2D無(wú)／檢查用水2A為供試品溶液；B為供試品陽(yáng)性對(duì)照；C為陽(yáng)性對(duì)照；D為陰性對(duì)照。λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/ml)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法1．溶液制備（1）供試品溶液制備：用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將供試品配成對(duì)應(yīng)的MVD的濃度A。（2）供試品陽(yáng)性對(duì)照液的制備：

用被測(cè)供試品溶液A將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成2λ濃度的內(nèi)毒素溶液B。（3）陽(yáng)性對(duì)照液的制備：用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成2λ濃度的內(nèi)毒素溶液C。（4）陰性對(duì)照液：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水D細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

MVD的確定和2λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液的制備。

最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）是指在試驗(yàn)中供試品溶液被允許達(dá)到稀釋的最大倍數(shù)，在不超過(guò)此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測(cè)。MVD=cL/λ

式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；c為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，則c等于1.0ml/ml，當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時(shí)，c的單位需為mg/ml或U/ml。如供試品為注射用無(wú)菌粉末或原料藥，則MVD取1，可計(jì)算供試品的最小有效稀釋濃度c=λ/L；λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/ml）難點(diǎn)釋疑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法1．細(xì)菌內(nèi)毒素（Endotoxin）是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分，由脂多糖組成。

2．細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法主要有凝膠法和光度測(cè)定法兩