薄層色譜法操作方法

無機(jī)與分析技術(shù)基礎(chǔ)化學(xué)教研室王雷清薄層色譜法-操作方法薄層色譜法操作方法四、操作方法1.制板2.點(diǎn)樣3.展開4.顯色5.定性和定量分析薄層色譜法薄層色譜法四、操作方法

薄層色譜法的一般操作程序可分為制板、點(diǎn)樣、展開、斑點(diǎn)定位、定性定量分析五個(gè)步驟。薄層色譜法（一）制板常用的薄板類型有：軟板（硅膠H板、氧化鋁板）、硬板（硅膠G板、氧化鋁G板、硅膠CMC-Na板、氧化鋁CMC-Na板)、F板(F254板、F365板)。F板為在吸附劑中加有波長(zhǎng)為254nm或365nm的熒光物質(zhì)。薄層色譜法

1.將一定粒度的吸附劑（固定相，例如硅膠、活性氧化鋁、纖維素等）均勻地涂鋪在表面光潔的玻璃板或塑料平板上，制成薄層板。

薄層色譜法吸附劑就其性質(zhì)而言，可分為有機(jī)吸附劑（如聚酰胺、纖維素和葡聚糖等）和無機(jī)吸附劑（如氧化鋁、硅膠、硅藻土、磷酸鈣、磷酸鎂和硅酸鈣鎂等）。最常用的是氧化鋁和硅膠，它們的吸附性能好，適用于多種化合物的分離。常用的吸附劑厚度為0.5～2.5mm，色譜板的尺寸一般為20cm×20cm或20cm×40cm。薄層厚度與薄層板的尺寸限制了PTLC可以分離的樣品量。1.0mm厚的硅膠板最多可上樣5mg／cm2。硅膠是最常用的吸附劑，可用它來分離親脂或親水性物質(zhì)。薄層色譜法

TLC板可以自己制備，也有預(yù)制板出售。自制TLC板的優(yōu)點(diǎn)在于吸附劑的厚度及組成可調(diào)節(jié)(最厚可達(dá)5mm)，也可以在吸附劑中摻入硝酸銀及緩沖物質(zhì)。硅膠黏和劑混合平鋪涂鋪器自然干燥一夜105～115℃活化煅石膏或羧甲基纖維素鈉水溶液薄層色譜法注意事項(xiàng)調(diào)制時(shí)慢慢攪拌，勿使產(chǎn)生氣泡。均勻涂布在玻璃板上，搖動(dòng)攤平，晾干。使用前放入烘箱內(nèi)，在105-115℃左右烘干40-50min。冷卻后使用。薄層色譜法（二）點(diǎn)樣

1．樣品溶液的制備溶解樣品的溶劑，盡量避免用水為溶劑。

2．點(diǎn)樣量點(diǎn)樣量的多少與薄層的性能及顯色劑的靈敏度有關(guān)。

3．點(diǎn)樣方法薄層色譜法2.把待分析試樣的溶液滴加在薄層板的起始線上（點(diǎn)樣），晾干

薄層板試樣原點(diǎn)

點(diǎn)樣是進(jìn)行TLC分離的一個(gè)最關(guān)鍵的步驟。上樣之前薄層板最好先用溶劑展開一次，以減少所需化合物從吸附劑洗脫下來時(shí)可能混入的雜質(zhì)。樣品溶解：上樣前先將樣品溶于少量溶劑，難揮發(fā)性溶劑可引起點(diǎn)樣帶變寬，因此最好選用揮發(fā)性溶劑(如己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等)，最好用與展開劑極性相似的溶劑，應(yīng)盡量使點(diǎn)樣后溶劑能迅速揮發(fā)，以減少色斑的擴(kuò)散。水溶性樣品，可先用少量水使其溶解，再用甲醇或乙醇稀釋定容。薄層色譜法

點(diǎn)樣示意圖反應(yīng)混合液樣原料樣1-2cm1cm≤點(diǎn)間距≤1.5cm點(diǎn)樣直徑≤2mm薄層色譜法薄層色譜法點(diǎn)樣注意事項(xiàng)a.樣品的濃度應(yīng)在5％～10％左右。點(diǎn)樣帶應(yīng)盡可能狹窄，以獲得更好的分離效果。溶解樣品的溶劑要盡量避免用水，因?yàn)樗芤喊唿c(diǎn)容易擴(kuò)散，且不易揮發(fā)。b.適當(dāng)?shù)狞c(diǎn)樣量，可使斑點(diǎn)集中，點(diǎn)樣量過大，易拖尾或擴(kuò)散；點(diǎn)樣量過少，不易檢出。點(diǎn)樣量多少，應(yīng)視薄層的性能及顯色劑的靈敏度而定，此外還應(yīng)考慮薄層的厚度。一般是幾微克到幾十微克。c.盡量用小的點(diǎn)樣管，如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點(diǎn)樣管。這樣，點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開的色譜圖分離度好，顏色分明。薄層色譜法（三）展開展開的過程就是混合物分離的過程，它必須在密閉的展開槽（多數(shù)是長(zhǎng)方型展開槽）或直立型的單槽色譜缸或雙槽色譜缸中進(jìn)行。展開方式：近水平展開、上行展開、多次展開、雙向展開等。3.把點(diǎn)有試液的薄層板浸入到作為展開劑的流動(dòng)相中（不要把試樣點(diǎn)浸入），流動(dòng)相裝在加蓋的層析缸中，并具有一定飽和的流動(dòng)相蒸氣壓。

展開示意圖薄層色譜法薄層色譜法展開：

將點(diǎn)好樣的薄板與流動(dòng)相接觸，使兩相相對(duì)運(yùn)動(dòng)并帶動(dòng)樣品組分遷移的過程稱為展開。

一般硬板常用上行法展開。將點(diǎn)樣后的薄板直立于已盛有展開劑的直立形層析槽的凸出處，不接觸底部的展開劑，加蓋飽和，再迅速將薄板置于槽底使之浸入展開劑中展開，直至展開劑上升一段距離（一般約15cm），取出薄板，用鉛筆畫出溶劑前沿位置。薄層色譜法把薄層板放入層析缸中，底端浸入適當(dāng)溶劑。

薄層色譜法注意事項(xiàng)：（1）色譜槽或色譜缸必須密閉良好：為使色譜槽內(nèi)展開劑蒸氣飽和并維持不變，應(yīng)檢查玻璃槽口與蓋的邊緣磨砂處是否嚴(yán)實(shí)。（2）注意防止邊緣效應(yīng)：邊緣效應(yīng)是指同一組分的斑點(diǎn)在同一薄板上出現(xiàn)的兩邊緣部分的Rf值大于中間部分的Rf值的現(xiàn)象。因此，在展開之前，通常將點(diǎn)好樣的薄板置于盛有展開劑的色譜缸內(nèi)飽和約一刻鐘（此時(shí)薄板不得浸入展開劑中）。薄層色譜法（四）斑點(diǎn)定位對(duì)于有色物質(zhì)斑點(diǎn)的定位可在日光下直接觀察測(cè)定。而對(duì)于無色物質(zhì)斑點(diǎn)，則必需采用某些輔助方法使其顯色。

方法如下：熒光檢出法化學(xué)檢出法碘蒸氣法、水斑點(diǎn)顯示方法、放射顯影法等

顯色與定位展開過程中，組分在兩相之間發(fā)生多次吸附—解吸平衡，吸附牢的組分隨展開劑移動(dòng)慢，吸附弱的組分隨展開劑移動(dòng)快，一段時(shí)后，組分被分離，各組分在薄層板上形成不同距離的斑點(diǎn)。前沿原點(diǎn)AB薄層色譜法薄層色譜法顯色與定位常見的顯色方法：物理顯色法：①熒光樣品，不少有機(jī)物在紫外燈照射下會(huì)出現(xiàn)不同的熒光，許多金屬離子與8-羥基喹啉的化合物在紫外線下也會(huì)呈現(xiàn)不同色調(diào)的熒光；②熒光背景，含熒光劑的薄層板在紫外線照射激發(fā)下背景顯熒光，無熒光性樣品斑點(diǎn)呈暗色。

生化顯色法：一些生化物質(zhì)對(duì)某些微生物的生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)或抑制作用。

薄層色譜法化學(xué)顯色法：

①噴射顯色，采用適宜的顯色劑與樣品組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成有色物質(zhì)；②蒸氣顯色，當(dāng)薄層板展開后放入氨氣、溴蒸氣、碘蒸氣中直接顯色；③硫酸顯色，用96﹪的硫酸噴射薄板并直接在火焰上或于100℃加熱，有機(jī)組分被碳化呈現(xiàn)黑色斑點(diǎn)。

絕大多數(shù)的PTLC吸附劑中含有熒光指示劑，它可幫助確定被分開的、具有紫外吸收化合物的色帶位置。對(duì)于沒有紫外吸收的化合物，可采用下列幾種方法定位：薄層色譜法向板上噴灑水(如用于皂苷類化合物)；在板上覆蓋一塊玻璃板，并在板的邊緣噴灑顯色劑；加入一種參照物。5.樣品的收集

在確定色帶位置后，可用刮刀或一與真空收集器相連的管形刮離器將該色帶吸附劑從板上刮下。后一種方法并不適用于敏感的物質(zhì)，因吸附劑持續(xù)與氣流接觸，所含的純化合物有被氧化的危險(xiǎn)。薄層色譜法(五)定性分析

要使測(cè)定的條件與文獻(xiàn)規(guī)定的條件完全一致比較困難。通常的方法是用對(duì)照法，即在同一塊薄層板上分別點(diǎn)上樣品和對(duì)照品進(jìn)行展開、定位。如果樣品的Rf值與對(duì)照品的Rf值相同，即Rs值=1，則可認(rèn)為該組分與對(duì)照品為同一物質(zhì)。有時(shí)為了進(jìn)一步可靠起見，還應(yīng)采用多種不同的展開系統(tǒng)進(jìn)行展開。如果所得到的Rf值與對(duì)照品均一致，才可基本認(rèn)定是同一物質(zhì)。

薄層色譜法影響Rf值的主要外部因素：

1．吸附劑的性質(zhì)吸附劑的種類和活度對(duì)物質(zhì)的Rf值有較大影響。

2．展開劑的性質(zhì)展開劑的極性直接影響物質(zhì)的移動(dòng)距離和速度，故對(duì)Rf值影響很大。

3．展開時(shí)的