現(xiàn)代分子生物學(xué)第五章

關(guān)于現(xiàn)代分子生物學(xué)第五章第1頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、定點突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心與基本技術(shù)。第2頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。第3頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

基因工程技術(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。事實上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。第4頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第5頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5.1重組DNA技術(shù)回顧三大成就：第一，在20世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者、即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)——解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；第二，50年代提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制——解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；第6頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第三，50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼——闡明了遺傳信息的流動與表達(dá)機(jī)制。第7頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月表5-1重組DNA技術(shù)史上的主要事件年份事件1869FMiescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。1957A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶I。1959-1960Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破譯了第一個遺傳密碼；Jacob和Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型。1964Yanofsky和Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。1965Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定；科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由“質(zhì)?！盌NA所決定。第8頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月1966Nirenberg，Ochoa，Khorana，Crick等人破譯了全部遺傳密碼。1967第一次發(fā)現(xiàn)DNA連接酶1970Smith，Wilcox和Kelley分離了第一種限制性核酸內(nèi)切酶，Temin和Baltimore從RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。1972-1973Boyer，Berg等人發(fā)展了DNA重組技術(shù)，于72年獲得第一個重組DNA分子，73年完成第一例細(xì)菌基因克隆。1975-1977Sanger與Maxam和Gilbert等人發(fā)明了DNA序列測定技術(shù)，1977年完成了全長5387bp的噬菌體φx174基因組測定。1978首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素。1980美國聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以被專利化。1981Palmiter和Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，Spradling和Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。1982美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物——胰島素，Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測定。第9頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月1983獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。1984斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。1986GMO首次在環(huán)境中釋放。1988Watson出任“人類基因組計劃”首席科學(xué)家。1989DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小鼠—“Oncomouse”。1992歐共體35個實驗室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測定(315kb)。1994第一批基因工程西紅柿在美國上市。1996完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測定。1997英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。2000完成第一個高等植物擬南芥的全序列測定（(1.15×108bp)。2001完成第一個人類基因組全序列測定(2.7×109bp)。第10頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

限制性核酸內(nèi)切酶能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個位點切開DNA分子。第一個核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實驗室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個位點切開并產(chǎn)生具有粘性末端或平端的小片段。

（1）限制性核酸內(nèi)切酶第11頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖5-1幾種主要DNA內(nèi)切酶所識別的序列及其酶切末端。第12頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

圖5-2DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個整體。a.DNA的粘性末端;b.DNA的平末端;c.化學(xué)合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。（2）DNA連接酶第13頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組，還不能滿足基因工程的要求，只有將它們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上，才能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。具備自主復(fù)制能力的DNA分子就是分子克隆的載體（vector）。病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。（3）分子克隆的載體第14頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

圖5-3重組DNA操作過程示意圖第15頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月目的基因的表達(dá)第16頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第18頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第19頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第20頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5.2DNA基本操作技術(shù)5.2.1核酸凝膠電泳技術(shù)

自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段。第21頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。第22頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

生理條件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，所以，DNA和RNA又被稱為多聚陰離子（polyanions），在電場中向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。第23頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個堿基對之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。第24頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月表5-2瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力

凝膠類型及濃度分離DNA的大小范圍（bp）

0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1第25頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

在凝膠電泳中，加入溴化乙錠（ethidiumbromide，EtBr）染料對核酸分子進(jìn)行染色，然后放置在紫外光下觀察，可靈敏而快捷地檢測出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。第26頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月溴化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相鄰堿基之間，并在300nm波長的紫外光照射下發(fā)出熒光。第27頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖5-4溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。

第28頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5.2.2細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖

所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。

第30頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)化(transformation)

特指以質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。轉(zhuǎn)染(transfection)

是指噬菌體、病毒或以它作為載體構(gòu)成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)

以噬菌體為媒介，將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。上述概念往往容易混淆。第31頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

轉(zhuǎn)化是一個自然存在的過程。細(xì)菌處于容易吸收外源DNA狀態(tài)叫感受態(tài)，用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作叫致敏過程。重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌的技術(shù)操作關(guān)鍵就是通過化學(xué)方法，人工誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)入一個敏感的感受態(tài)，以便外源DNA進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)。這項技術(shù)始于Mandel和Higa1970年的觀察，他們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌經(jīng)過冰冷的CaCl2溶液處理及短暫熱休克后，容易被λ噬菌體DNA感染，隨后Cohn于1972年進(jìn)一步證明質(zhì)粒DNA用同樣的方法也可進(jìn)入細(xì)菌。第32頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)化原理：將快速生長中的大腸桿菌置于經(jīng)0℃預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，使細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，易與外源DNA相粘附并在細(xì)胞表面的復(fù)合物。

42℃下做短暫熱刺激，復(fù)合物便會被細(xì)胞所吸收。在全培養(yǎng)基中生長一段時間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)，就可涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。細(xì)菌轉(zhuǎn)化及藍(lán)白斑篩選：圖5-5第33頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖5-6λ噬菌體可以作為克隆載體第34頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第35頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5.2.3聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）

首先將雙鏈DNA分子加熱分離成兩條單鏈，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的四種dNTP合成新生的DNA互補(bǔ)鏈。因為DNA聚合酶需要有一小段雙鏈DNA來啟動（“引導(dǎo)”）新鏈的合成，所以，新生DNA鏈的起點由寡核苷酸引物在模板DNA鏈兩端的退火位點所決定。第36頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

由于在PCR反應(yīng)中所選用的一對引物，是按照與擴(kuò)增區(qū)段兩端序列彼此互補(bǔ)的原則設(shè)計的，因此每一條新生鏈的合成都是從引物的退火結(jié)合位點開始并朝相反方向延伸的。第37頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

整個PCR反應(yīng)的全過程，即DNA解鏈（變性）、引物與模板DNA相結(jié)合（退火）、DNA合成（鏈的延伸）三步，可以被不斷重復(fù)。經(jīng)多次循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)，即兩條引物結(jié)合位點之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值應(yīng)是2n。第38頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖5-8PCR指數(shù)擴(kuò)增時循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)物數(shù)量的比較。第39頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月主要步驟：將含有待擴(kuò)增DNA樣品的反應(yīng)混合物放置在高溫（>94℃）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA。第40頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

然后降低反應(yīng)溫度（約50℃），致冷1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA發(fā)生退火作用并結(jié)合在靶DNA區(qū)段兩端的互補(bǔ)序列位置上。第41頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月最后，將反應(yīng)混合物的溫度上升到72℃左右保溫1-數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3'-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互補(bǔ)鏈。第42頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖。（a）起始材料，雙鏈DNA；（b）反應(yīng)混合物加熱后發(fā)生鏈分離，降溫使引物結(jié)合到待擴(kuò)增靶DNA區(qū)段兩端的退火位點上；（c）Taq聚合酶以單鏈DNA為模板在引物的引導(dǎo)下利用反應(yīng)混合物中的dNTPs合成互補(bǔ)的新鏈DNA；（d）將反應(yīng)混合物再次加熱，使舊鏈和新鏈分開；（e）合成新的互補(bǔ)鏈DNA；（f）重復(fù)b；（g）重復(fù)c、、、、、、第43頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計一般遵循下列原則：

(1)引物長度以15~30bp為宜。

(2)引物堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物G+C含量宜在45~55%左右。

(3)引物內(nèi)部不應(yīng)形成二級結(jié)構(gòu)，兩個引物之間尤其在3'末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在。

(4)引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。要求在引物設(shè)計時采用計算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析。

(5)引物3‘末端堿基:原則上要求引物3’末端與模板DNA一定要配對。

(6)引物5'末端堿基:PCR反應(yīng)物5'末端堿基并沒有嚴(yán)格的限制，只要與模板DNA結(jié)合的引物長度足夠，其5'末端堿基可以不與模板DNA匹配而呈游離狀態(tài)。

第44頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR反應(yīng)引物設(shè)計:PCR作為一個體外酶促反應(yīng)，其效率和特異性取決于兩個方面:一是引物與模板的特異結(jié)合二是多聚酶對引物的有效延伸基因組DNA作為模板時，由于其數(shù)量的龐大及結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除了特異擴(kuò)增外，往往很容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。引物設(shè)計的總原則就是提高擴(kuò)增的效率和特異性。第45頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5.2.4實時定量PCR（Realtime-PCR）

普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物總量變化大。實時定量PCR技術(shù)：利用帶熒光檢測的PCR儀對PCR過程DNA累積作出動態(tài)監(jiān)測。熒光染料：SYBRGreenI：圖5-9TaqMan探針：圖5-10第46頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5.2.5基因組DNA文庫構(gòu)建

基因組DNA文庫構(gòu)建：把某種生物基因組DNA切成適當(dāng)大小，分別與載體組合，導(dǎo)入微生物細(xì)胞，形成克隆。匯集包含基因組中所有DNA序列的克隆，稱為基因組DNA文庫?；蚪MDNA文庫構(gòu)建示意圖：圖5-13

常用載體：噬菌體；柯斯質(zhì)粒；

BAC；PAC；YAC第47頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5.3RNA基本操作技術(shù)在DNA水平上分離真核生物的靶基因難度大：基因組DNA龐大；大量重復(fù)序列；有內(nèi)含子。而分離mRNAcDNA目的基因工作簡單，速度快。但是，RNA分子：敏感，穩(wěn)定性差，某些基因的mRNA具有時相和轉(zhuǎn)錄的特殊性。第48頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5.3.1總RNA的提取1、操作要求高：選擇合適的時相、采用適當(dāng)?shù)臈l件與材料，避免降解。2、方法：Trizol法。由苯酚和異硫氰酸胍組成，可迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使RNA釋放，并保持RNA完整。3、濃度和純度鑒定：通過OD260/OD280的比值來鑒定第49頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5.3.2mRNA的純化

根據(jù)mRNA3’端具有polyA尾巴的特點，利用寡聚（dT）-纖維素柱色譜法純化獲得高純度的mRNA。圖5-14第50頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖5-14PolyATtractmRNA的分離純化過程簡圖第51頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5.3.3cDNA的合成使用oligodT或隨機(jī)引物，通過RT-PCR法（——逆轉(zhuǎn)錄酶）。圖5-15定向cDNA的合成與分子修飾：圖5-16第52頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖5-15cDNA合成過程示意圖第53頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5.3.4cDNA文庫的構(gòu)建獲得的含有某種組織器官cDNA信息的噬菌體文庫，可用于篩選目的基因、大規(guī)模測序、基因芯片雜交等功能。做法：mRNAcDNA載體大腸桿菌一個完整的cDNA文庫通常包含大于500000的獨立克隆。第54頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5.3.5基因文庫的篩選通過某種特定的方法從基因文庫中鑒定出含有所需DNA分子的特定克隆過程。1、核酸雜交法（Sourthernblotting）：圖5-172、PCR篩選法3、免疫篩選法（Westernblotting）：該法適用于對表達(dá)文庫的篩選。圖5-18第55頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5.4SNP的理論與應(yīng)用SNP：singlenucleotidepolymorphism，單核苷酸多態(tài)性。具有很高的遺傳穩(wěn)定性，是繼限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、RAPD和微衛(wèi)星DNA（SSR）標(biāo)記之后的第三代遺傳標(biāo)記。第56頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphisma）技術(shù)

RFLP標(biāo)記是發(fā)展最早的DNA標(biāo)記技術(shù)。

RFLP是指基因型之間限制性片段長度的差異，這種差異是由限制性酶切位點上堿基的插入、缺失、失重排或點突變所引起的。RFLP技術(shù)主要包括以下基本步驟：

DNA提取→用限制性內(nèi)切酶酶切DNA→用凝膠電泳分開DNA片段→把DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上→利用放射性標(biāo)記的探針雜交顯示特定的DNA片段（Southern雜交）和結(jié)果分析。

第57頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第58頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第59頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月RAPD技術(shù)RAPD（(RandomAmplifiedPolymorphicDNA）技術(shù)是建立在PCR(PolymeraseChainReaction)基礎(chǔ)之上的一種可對整個未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子技術(shù)。其以基因組DNA為模板,以單個人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列(通常為10個堿基對)為引物,在熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(Taq酶)作用下,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后,在紫外透視儀上檢測多態(tài)性。擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性。RAPD技術(shù)現(xiàn)已廣泛的應(yīng)用于生物的品種鑒定、系譜分析及進(jìn)化關(guān)系的研究上。第60頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第61頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月SSR（simplesequencerepeats）技術(shù)微衛(wèi)星DNA：重復(fù)單位序列最短，只有2～6bp，串聯(lián)成簇，長度50～100bp，又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列（ShortTandemRepeatSTR)。廣泛分布于基因組中。SSR標(biāo)記的基本原理：根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補(bǔ)序列設(shè)計引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，因而能夠用PCR的方法擴(kuò)增出不同長度的PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)分離片段的大小決定基因型并計算等位基因頻率。

第62頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月SNP檢測技術(shù)傳統(tǒng)SNP檢測方法：RFLP、PCR-SSCP、DHPLC等，最終均需通過凝膠電泳分析，通量受到限制，并只能判斷有無，而不知堿基類型。必須進(jìn)行DNA測序?；蚍中停豪脭?shù)據(jù)庫已有SNP進(jìn)行特定人群序列和發(fā)生頻率研究，包括如下方法：第63頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月1、基因芯片技術(shù)：通過優(yōu)化芯片雜交程序，使探針只與完全互補(bǔ)的序列雜交，而不與含有單個錯配堿基序列雜交。2、Taqman技術(shù)：運用了熒光共振能量轉(zhuǎn)換（FRET）技術(shù)。3、分子信標(biāo)技術(shù)：也運用了FRET技術(shù)。4、焦磷酸測序法第64頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月SNP的應(yīng)用1、人類基因單體的繪圖2、SNP與疾病易感基因的相關(guān)性分析3、指導(dǎo)用藥與藥物設(shè)計第65頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5.5基因克隆技術(shù)在多細(xì)胞的高等生物個體水平上，人們用克隆（clone）表示由具有相同基因型的同一物種的兩個或數(shù)個個體組成的群體。在細(xì)胞水平上，克隆是指由同一個祖細(xì)胞分裂而來的一群帶有完全相同遺傳物質(zhì)的子細(xì)胞。第66頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

在分子生物學(xué)中，人們把將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復(fù)制的過程稱為克?。▌釉~）。第67頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月基因克隆，包括目的基因的分離和鑒定兩個內(nèi)容，分四個基本步驟：(1)DNA材料的選擇與片段化；(2)外源DNA片段與載體分子的體外連接反應(yīng)；(3)將人工重組的DNA分子導(dǎo)入它們能夠進(jìn)行正常復(fù)制的寄主細(xì)胞；(4)重組轉(zhuǎn)化子克隆的選擇或篩選。*真核生物基因（大，有重復(fù)序列）———cDNA克隆法法。

第68頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月RACE（RaidamplificationofcDNAends）技術(shù)是一項在已知cDNA序列（部分）的基礎(chǔ)上克隆5’或3’端缺失序列的技術(shù)。主要操作步驟如圖5-22所示。RACE技術(shù)除了用于獲得全長cDNA序列外，還被應(yīng)用于識別獲得5’和3’端非轉(zhuǎn)錄序列。5.5.1RACE技術(shù)第69頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

該法通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴(kuò)增目的基因片段。因為Tester和Driver在接受差示分析前均經(jīng)一個4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群，保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。5.5.2應(yīng)用cDNA差示分析法克隆基因第70頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖5-23RDA流程圖。第71頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月1、基因大規(guī)?？寺〉哪康腉ateway技術(shù)利用噬菌體進(jìn)行位點特異性DNA片段重組，實現(xiàn)不需要傳統(tǒng)的酶切連接過程的基因快速克隆和載體間平行轉(zhuǎn)移，為大規(guī)?？寺』蚪M注釋的可譯框架提供了保障。

2、Gateway克隆技術(shù)要點（1）Topo反應(yīng)：將目的基因PCR產(chǎn)物連入Entry載體（2）LR反應(yīng)：將目的片斷從Entry載體重組入表達(dá)載體圖5-24a，5-24b。5.5.3Gateway大規(guī)模克隆技術(shù)第72頁，課