腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中常用技術(shù)17-18

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中常用技術(shù)17-18第一頁(yè)，共46頁(yè)。細(xì)胞凋亡細(xì)胞增殖失控與端粒酶細(xì)胞分化侵襲與轉(zhuǎn)移抑癌基因失活原癌基因激活

一、腫瘤發(fā)生中的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制第二頁(yè)，共46頁(yè)。二、腫瘤體外培養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：1.免受機(jī)體內(nèi)部因素影響2.可長(zhǎng)期保存3.快速篩選抗癌藥4.費(fèi)用低缺點(diǎn)：與體內(nèi)環(huán)境有差異，應(yīng)結(jié)合體內(nèi)試驗(yàn)第三頁(yè)，共46頁(yè)。腫瘤細(xì)胞取材及培養(yǎng)一般取自患者。實(shí)體瘤：原發(fā)癌組織或轉(zhuǎn)移灶胸、腹腔炎：胸水或腹水白血?。貉夯蚬撬枰鹤ⅲ喝〔暮蠹皶r(shí)培養(yǎng)勿放置過(guò)久第四頁(yè)，共46頁(yè)。常用的腫瘤細(xì)胞系1.2.（美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)中國(guó)代理）3.第五頁(yè)，共46頁(yè)。三、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中常用技術(shù)1.抗癌藥物敏感性試驗(yàn)2.腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移體外模型的建立第六頁(yè)，共46頁(yè)。1.抗癌藥物敏感性試驗(yàn)美藍(lán)法染料排斥法生長(zhǎng)曲線測(cè)定法集落形成試驗(yàn)法MTT比色法裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)法第七頁(yè)，共46頁(yè)。美藍(lán)法原理：利用活細(xì)胞的脫氫酶提供氫離子，使甲烯藍(lán)（美藍(lán)）還原為甲烯白（無(wú)色），細(xì)胞死亡之后，脫氫酶失活，無(wú)法使甲烯藍(lán)還原，因此被染成藍(lán)色，檢測(cè)用藥后的死細(xì)胞數(shù)能反映藥物的抑瘤作用。缺點(diǎn)：假陽(yáng)性率高第八頁(yè)，共46頁(yè)。臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)原理：臺(tái)盼藍(lán)能使死細(xì)胞著色（淡藍(lán)色），而活細(xì)胞拒染。

活細(xì)胞總數(shù)×100活細(xì)胞率（％

）＝活細(xì)胞總數(shù)＋死細(xì)胞總數(shù)注意：簡(jiǎn)單，最常用。染色時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)第九頁(yè)，共46頁(yè)。生長(zhǎng)曲線測(cè)定法原理：癌細(xì)胞在最適條件下呈指數(shù)生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于試驗(yàn)，以細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間可得一條生長(zhǎng)曲線，比較加藥組合對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，可反映出藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。第十頁(yè)，共46頁(yè)。dCellnumber(×104)lg計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷率、藥物對(duì)細(xì)胞倍增時(shí)間影響、藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)飽和密度影響第十一頁(yè)，共46頁(yè)。集落形成試驗(yàn)法原理：腫瘤細(xì)胞系由不同比例增殖及分化能力不同的細(xì)胞組成，其中含有極少部分具有自我復(fù)制和增值能力的干細(xì)胞，具有分化和形成集落的特性，約占1%，其與腫瘤治愈、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因其具有分化及形成集落的能力，故用集落法可體外檢測(cè)抗癌藥物敏感性。第十二頁(yè)，共46頁(yè)。四唑鹽（MTT）比色法商品名為噻唑藍(lán)原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。第十三頁(yè)，共46頁(yè)。XTT比色法：與MTT類似，但產(chǎn)生的橙黃色甲儹（formazan）溶于水。缺點(diǎn)：水溶液不穩(wěn)定，需低溫保存或現(xiàn)用現(xiàn)配。CCK-8比色法：1.產(chǎn)生的formazan都是水溶性，檢測(cè)靈敏度更高。2.更加穩(wěn)定，酚紅和血清對(duì)其測(cè)定無(wú)明顯影響

對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性，3.加入顯色后，可以在不同時(shí)間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀板，使檢測(cè)時(shí)間更加靈活，便于找到最佳測(cè)定時(shí)間

第十四頁(yè)，共46頁(yè)。放射性同位素?fù)饺敕?/p>

危險(xiǎn)性大，少用第十五頁(yè)，共46頁(yè)。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)法（詳見下章）裸鼠特點(diǎn)：先天性無(wú)胸腺，故胸腺依賴的免疫功能缺乏異種移植無(wú)排斥反應(yīng)，可進(jìn)行人體腫瘤移植，且形成的腫瘤仍能保留原有組織學(xué)形態(tài)、特點(diǎn)。第十六頁(yè)，共46頁(yè)。應(yīng)用：1.體外瘤培養(yǎng)細(xì)胞株的鑒定2.研究腫瘤在體內(nèi)的生物學(xué)行為3.藥物作用機(jī)理研究第十七頁(yè)，共46頁(yè)。2.腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移體外模型的建立轉(zhuǎn)移過(guò)程：①癌細(xì)胞從原發(fā)灶脫落，形成轉(zhuǎn)移灶②浸潤(rùn)到靶目標(biāo)：對(duì)靶目標(biāo)基底膜的黏附、破壞基底膜、浸潤(rùn)。此過(guò)程為抑制癌轉(zhuǎn)移藥物篩選、開發(fā)提供思路。第十八頁(yè)，共46頁(yè)。模型主要包括：1）細(xì)胞體外黏附實(shí)驗(yàn)2）腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)3）腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)4）腫瘤轉(zhuǎn)移試驗(yàn)第十九頁(yè)，共46頁(yè)。1）細(xì)胞體外黏附實(shí)驗(yàn)細(xì)胞黏附性：腫瘤細(xì)胞通過(guò)膜表面受體（整合素、鈣粘蛋白和層粘蛋白受體）黏附于基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)成分上（如纖維連接蛋白、層粘蛋白和IV型膠原蛋白）。作用：維持細(xì)胞外形、調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、運(yùn)動(dòng)。黏附是癌細(xì)胞侵襲的開始。第二十頁(yè)，共46頁(yè)。（1）腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上黏附的測(cè)定原理：高侵襲的腫瘤細(xì)胞與基底膜成分的異質(zhì)性黏附能力通常增高，而腫瘤細(xì)胞間的同質(zhì)性黏附能力則會(huì)下降。此特性有利于腫瘤細(xì)胞與腫瘤母體的分離，并侵犯基底膜等正常組織。主要試劑：人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel（主要成分為層粘蛋白和IV型膠原蛋白）、纖維連接蛋白（FN）、小牛血清白蛋白（BSA）、MTT。第二十一頁(yè)，共46頁(yè)。方法步驟：1）包被基底膜2）水化基底膜3）接種并培養(yǎng)細(xì)胞4）MTT檢測(cè)黏附率（%）=[（實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞A值/BSA組細(xì)胞A值）-1]×100第二十二頁(yè)，共46頁(yè)。（2）腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附測(cè)定

腫瘤細(xì)胞與脈管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附有利于其在脈管壁著床。原理：利用腫瘤細(xì)胞對(duì)活性染料RoseBengal的攝取量來(lái)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附反應(yīng)。體外培養(yǎng)細(xì)胞攝取RoseBengal后，整個(gè)胞漿被染紅，腫瘤細(xì)胞數(shù)越多，攝取的染料越多，吸光度A值越大。內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)染料攝取少且穩(wěn)定，A值基本不變。第二十三頁(yè)，共46頁(yè)。方法:

96孔板底層鋪單層胎兒臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，上層鋪腫瘤細(xì)胞，染色后，用ELISA儀測(cè)A值。A值=內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞A值-內(nèi)皮細(xì)胞A值第二十四頁(yè)，共46頁(yè)。2）腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)原理：遷移是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中必不可少的環(huán)節(jié)之一。腫瘤細(xì)胞侵襲周邊正常組織需要一定的運(yùn)動(dòng)能力。高轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞通常具有較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)性。多種物質(zhì)可刺激腫瘤細(xì)胞的遷移，如腫瘤細(xì)胞分泌因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分等對(duì)腫瘤細(xì)胞有趨化作用，可使其發(fā)生定向運(yùn)動(dòng)。方法：創(chuàng)傷試驗(yàn)?zāi)Ｐ?、培養(yǎng)小室模型等第二十五頁(yè)，共46頁(yè)。（1）創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

本法借鑒體外細(xì)胞致傷愈合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，測(cè)定腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上的運(yùn)動(dòng)特性。主要試劑：人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel（主要成分為層粘蛋白和IV型膠原蛋白）、纖維連接蛋白（FN）、小牛血清白蛋白（BSA）。第二十六頁(yè)，共46頁(yè)。方法步驟：1）包被基底膜2）水化基底膜3）接種并培養(yǎng)細(xì)胞4）人工劃痕并測(cè)定原始距離（加入藥物）5）測(cè)量遷移距離：根據(jù)原始距離計(jì)算細(xì)胞實(shí)際遷移距離第二十七頁(yè)，共46頁(yè)。第二十八頁(yè)，共46頁(yè)。第二十九頁(yè)，共46頁(yè)。（2）培養(yǎng)小室模型原理：體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞在趨化作用下可穿過(guò)多孔生物膜，穿膜細(xì)胞經(jīng)染色后顯微鏡下計(jì)數(shù)或MTT比色測(cè)定OD值。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期短、易定量分析。應(yīng)用：研究細(xì)胞分化和細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用、觀察藥物對(duì)細(xì)胞侵襲的影響。第三十頁(yè)，共46頁(yè)。第三十一頁(yè)，共46頁(yè)。（3）瓊脂糖滴模型原理方法：將癌細(xì)胞、培養(yǎng)液和瓊脂糖混合成瓊脂糖細(xì)胞懸液，然后在培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿底制成瓊脂糖小滴，經(jīng)低溫凝固，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，不同時(shí)間測(cè)量腫瘤細(xì)胞從瓊脂糖滴邊緣移出的距離，評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞移動(dòng)能力。第三十二頁(yè)，共46頁(yè)。3）腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)1）體內(nèi)癌細(xì)胞侵襲模型

①皮下移植侵襲模型

②肌肉內(nèi)移植侵襲模型

③腹腔內(nèi)移植侵襲模型

④小鼠腎包膜下移植侵襲模型

⑤鼠睪丸包膜下移植侵襲模型

⑥小鼠耳廓皮下移植侵襲模型

⑦鼠爪墊皮下移植侵襲模型

⑧視網(wǎng)內(nèi)界膜侵襲模型

2）體外癌細(xì)胞侵襲模型

①體外靜止器官培養(yǎng)法

②半體外半體內(nèi)器官培養(yǎng)法

③單層細(xì)胞器官培養(yǎng)法

④瘤細(xì)胞球體器官培養(yǎng)法

⑤單層細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

⑥Transwell侵襲小室測(cè)定法

第三十三頁(yè)，共46頁(yè)。Transwell侵襲小室測(cè)定法

外形為一個(gè)可放置在孔板里的小杯子，杯子底層的一張有通透性的膜，一般常用的是聚碳酸酯膜，將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。

細(xì)胞種在上室內(nèi)，可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響。應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過(guò)不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。

第三十四頁(yè)，共46頁(yè)。第三十五頁(yè)，共46頁(yè)。常見實(shí)驗(yàn)：(1).共培養(yǎng)體系：

小于3.0um孔徑條件下，細(xì)胞不會(huì)遷徙通過(guò)，將細(xì)胞A種于上室，細(xì)胞B種于下室，可以研究細(xì)胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞A的影響。第三十六頁(yè)，共46頁(yè)。(2).趨化性實(shí)驗(yàn)

可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室細(xì)胞可穿過(guò)聚碳酸酯膜進(jìn)入下室，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映下室成分對(duì)上室細(xì)胞的趨化能力。

①細(xì)胞B對(duì)細(xì)胞A的趨化作用：將細(xì)胞A種于上室，細(xì)胞B種于下室，可以研究細(xì)胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞A的趨化作用。

②趨化因子對(duì)細(xì)胞的趨化作用：將細(xì)胞種于上室，下室加入某種趨化因子，可研究該趨化因子對(duì)細(xì)胞的趨化作用。第三十七頁(yè)，共46頁(yè)。(3).腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

常用8.0、12.0μm膜，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會(huì)向營(yíng)養(yǎng)成分高的下室跑，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。第三十八頁(yè)，共46頁(yè)。(4).腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

常用8.0、12.0μm膜，原理與腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)類似。第三十九頁(yè)，共46頁(yè)。方法步驟：

1.Transwell小室制備

①包被基底膜（若有基質(zhì)膠此步略去）：

②水化基底膜：2.制備細(xì)胞懸液3.接種細(xì)胞4.結(jié)果統(tǒng)計(jì)：直接計(jì)數(shù)法、間接計(jì)數(shù)法

第四十頁(yè)，共46頁(yè)。直接計(jì)數(shù)法：“貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)

“貼壁”指細(xì)胞穿過(guò)膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會(huì)掉到下室里面去。①用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞

②染色：常用結(jié)晶紫染色、臺(tái)肦藍(lán)、Giemsa、蘇木精、伊紅等。③細(xì)胞計(jì)數(shù)：顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，隨機(jī)選取若干個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞。一般3－5個(gè)，選擇盡可能多的視野。

間接計(jì)數(shù)法

當(dāng)穿過(guò)細(xì)胞過(guò)多無(wú)法通過(guò)計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)用，常用MTT、熒光試劑檢測(cè)、結(jié)晶紫檢測(cè)。

第四十一頁(yè)，共46頁(yè)。注意：1.有侵襲能力的細(xì)胞才可用于Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。建議實(shí)驗(yàn)前先用酶譜法檢測(cè)MMPs的表達(dá)，特別是MMP-2的表達(dá)。2.為了讓實(shí)驗(yàn)結(jié)果更明顯，可先用無(wú)血清培養(yǎng)基讓細(xì)胞饑餓12－24h，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3.下層培養(yǎng)液和小室間避免產(chǎn)生氣泡。

第四十二頁(yè)，共46頁(yè)。常用公司產(chǎn)品及價(jià)格：

Costar、Corning、BD生產(chǎn)的小室Coster：24孔板的transwell：456元,8μm。Corning：catNo.3422.6.5mmtranswellwith8.0umprore,48,950元。平均每個(gè)20元。BD價(jià)格：240元一塊（6.5um,24孔,12instert）Millipore：8μm的50個(gè)1760元,0.4μm，2000,一次性。國(guó)產(chǎn)：30塊一個(gè)。第四十三頁(yè)，共4