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
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CONTENTS目錄Part1引物設(shè)計(jì)原則Part
2獲取目的基因Part
3引物設(shè)計(jì)目前一頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)引物的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡:擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率PARTONE目前二頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)12引物長(zhǎng)度一般引物長(zhǎng)度為18~30堿基。決定引物熔解溫度(Tm值)最重要的因素就是引物的長(zhǎng)度。長(zhǎng)度越長(zhǎng),Tm值越大。長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng),退火溫度和延長(zhǎng)溫度相差太小,不利于延伸反應(yīng)。長(zhǎng)度過(guò)短,特異性低GC含量一般為40%~60%,一對(duì)引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴(yán)重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴引物設(shè)計(jì)原則目前三頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)3引物自身和引物之間引物自身不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)(如發(fā)夾結(jié)構(gòu))引物設(shè)計(jì)原則引物之間不能形成二聚體(包括同種引物之間或上游引物與下游引物之間)且引物不能與DNA其他區(qū)域錯(cuò)配目前四頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)引物設(shè)計(jì)原則4引物末端引物3′端:由于延伸從3′端開始,因而不能進(jìn)行任何修飾;同時(shí)不應(yīng)選擇A,因?yàn)锳-A、A-G錯(cuò)配。3’端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C,因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)引物5′端:主要限定引物長(zhǎng)度,對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大;可以修飾,如添加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),將PCR產(chǎn)物亞克隆目前五頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)引物設(shè)計(jì)原則引物5′端修飾技術(shù)附加核酸序列用途
限制酶位點(diǎn)克?。ㄈ缍ㄏ蚩寺。┦删w啟動(dòng)子合成RNA探針、測(cè)序蛋白質(zhì)結(jié)合序列產(chǎn)物純化、檢測(cè)核糖體結(jié)合序列高效表達(dá)加錯(cuò)配堿基造成突變定點(diǎn)誘變5避開靶基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)目前六頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)PARTTWO獲取目的基因利用Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋DNA、mRNA或者蛋白質(zhì)序列來(lái)設(shè)計(jì)引物目前七頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)獲取目的基因/genbank/目前八頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)目前九頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)mRNA對(duì)應(yīng)DNA序列蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)編碼區(qū)目前十頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)外顯子對(duì)應(yīng)的DNA序列、基因、編號(hào)目前十一頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)單擊CDS后目前十二頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)PARTTHREE引物設(shè)計(jì)利用生物軟件和網(wǎng)頁(yè)進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)目前十三頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)引物設(shè)計(jì)Primerpremier5最常用的引物設(shè)計(jì)軟件Oligo7常和PP5聯(lián)用評(píng)估引物NCBIPrimer-blast近幾年NCBI推出的網(wǎng)站目前十四頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)目前十五頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)此區(qū)域輸入待測(cè)DNA序列目前十六頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)目前十七頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)目前十八頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)目前十九頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)目前二十頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)上游引物下游引物引物設(shè)計(jì)結(jié)果(一例)引物與DNA結(jié)合情況目前二十一頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)RT-PCR由于后面要應(yīng)用于RT-PCR,復(fù)制的是cDNA,而cDNA中沒(méi)有內(nèi)含子,所以在設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)該用編碼區(qū)結(jié)果:目前二十二頁(yè)\總數(shù)二十五頁(yè)\編于十五點(diǎn)簡(jiǎn)并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。簡(jiǎn)并引物M--ACS--GCW--ATR--GAY--TCK--GTB--GTCD--GATH--ACTV--GCAN--AGC
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