WATERS液相色譜教程三四七(最全)

啟動液相色譜儀器的流程開啟HPLC系統(tǒng)各個設(shè)備的電源打開泵、自動進(jìn)樣器、檢測器電源，待設(shè)備通過自檢后，打開計算機(jī)，啟動色譜管理軟件準(zhǔn)備流動相過濾,脫氣色譜泵排氣用新配制的流動相灌注泵目前一頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)啟動液相色譜儀器的流程用準(zhǔn)備好的流動相平衡色譜系統(tǒng)可在泵的控制面板上設(shè)定流速參數(shù)(15×5泵需在軟件控制下操作)系統(tǒng)大約需平衡0.5--1小時方能穩(wěn)定工作準(zhǔn)備樣品用流動相溶樣或重組樣品編制儀器方法,開始實驗?zāi)壳岸揬總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)液相色譜對流動相的要求色譜柱對流動相的要求過濾除去微粒純度的要求超純水，或用KMnO4處理過的雙蒸水有機(jī)溶劑：色譜純(溶劑中的雜質(zhì)含量盡可能低)，并與填料相匹配緩沖液的pH值，在填料的允許范圍(一般在pH2-8)內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度不要太高(≤100mM)流動相對樣品的溶解度調(diào)整有機(jī)溶劑和水的比例最好用流動相溶樣目前三頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)液相色譜對流動相的要求液相色譜儀器對流動相的要求∶與檢測器匹配脫氣避免用含鹵素離子的緩沖鹽（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度防止細(xì)菌的生長目前四頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)流動相的脫氣流動相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液量均勻準(zhǔn)確，并且脈動減小保留時間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化目前五頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)流動相脫氣的方法加熱簡單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動相組成的變化抽真空同上，一般在溶劑抽濾的同時，也有脫氣的效果超聲波振蕩簡單，但效果不夠理想；超聲時間不要太長(1分鐘左右即可)通惰性氣體（一般用氦氣）可保持在線連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度在線脫氣機(jī)（in-linedegasser)可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度目前六頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)流動相的保存有機(jī)溶劑流動相:室溫下密封,避光保存緩沖鹽流動相:當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用低溫下密封保存,一般不超過3天防止微生物生長有機(jī)溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動相:低溫密封保存防止有機(jī)相的揮發(fā)選用適宜的容器目前七頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)2星期1天1星期1小時新鮮配制5101520250分保存于聚乙烯瓶中的超純水測試條件水樣:40mltraceenrichment@2.0ml/min色譜柱:C18反相柱(Waters)梯度:線性100%水－100%乙腈波長:254nm目前八頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)1天1星期新鮮配制5101520250分保存于棕色玻璃瓶中的超純水測試條件水樣:40mltraceenrichment@2.0ml/min色譜柱:C18反相柱(Waters)梯度:線性100%水－100%乙腈波長:254nm目前九頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)色譜泵的排氣操作色譜泵實驗前，應(yīng)先確認(rèn)泵頭內(nèi)沒有氣體，如有氣體要按以下步驟排氣：將泵入口管吸濾頭放入脫過氣的流動相中打開泵及在線脫氣機(jī)電源開關(guān)將排液閥打開，或斷開與色譜柱連接的管路設(shè)置流速到6-9ml/min,排液閥出口有液流連續(xù)流出必要時(600泵)用10ml注射器從泵入口注入流動相對于600,2695四元梯度泵,分別對所用各路溶劑進(jìn)行排氣操作停止泵流速,關(guān)閉排液閥,恢復(fù)斷開的管路,備用注:泵排氣后,應(yīng)輸液穩(wěn)定(系統(tǒng)壓力脈動小,一般在幾十Psi以內(nèi)),否則,需重做排氣操作目前十頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)Waters515泵的前面板電源開關(guān)柱塞桿清洗孔排液閥目前十一頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)Waters600泵的前面板柱塞桿清洗孔電源開關(guān)排液閥泵控制器泵體泵灌注閥目前十二頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)Waters2695分離單元溶劑瓶盤注射器箱門柱溫箱溶劑配比單元進(jìn)入門檢測器接液盤前面板顯示屏和鍵盤軟盤驅(qū)動器樣品室門溶劑輸送單元進(jìn)入門目前十三頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)2695排氣操作示意圖面板操作:打開狀態(tài)(Statas)畫面按右下角DirectFunction功能鍵選DryPime或WetPrime命令選OK即可進(jìn)行泵的排氣注:當(dāng)流路中充滿空氣時,按圖示做DryPrime若只是更新流動相時,只須作WetPrime目前十四頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)

關(guān)于色譜系統(tǒng)的反壓什么是反壓(backpressure)流動相流經(jīng)管路及色譜柱時會有阻力,即所謂的反壓,又稱系統(tǒng)反壓或系統(tǒng)壓力Waters習(xí)慣用的壓力單位是Psi(磅/平方英吋)其它單位有:Bar,Mpa影響系統(tǒng)反壓的主要因素:流動相的溶劑組成溫度流速目前十五頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)

反壓與溶劑組成的關(guān)系流動相的粘度是產(chǎn)生反壓的主要原因有機(jī)溶劑－水的粘度隨組成而改變其壓力隨組成變化如下圖所示目前十六頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)

反壓與流速的關(guān)系流速對反壓的影響是線性關(guān)系流速增加，反壓亦增大下圖的實驗條件：2.1×30mmSymmetryC18柱,20℃目前十七頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)

反壓與溫度的關(guān)系溫度對反壓的影響是反比關(guān)系溫度升高,反壓降低,對某些流動相的影響更大一些

目前十八頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)

影響系統(tǒng)反壓的其它因素反壓與色譜柱長度成正比反壓與填料顆粒度的平方成反比2.5μm填料比3.5μm填料反壓高反壓與管路直徑的四次方成反比(1/D4)反壓與管路的長度成正比目前十九頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)色譜泵的運(yùn)行排氣后的色譜泵即可用于實驗運(yùn)行注意∶排氣后，先設(shè)流速為0恢復(fù)排氣時斷開的部分，如:進(jìn)樣器、色譜柱如需要，恢復(fù)排氣時斷開的控制線根據(jù)色譜柱的不同，逐漸提高流速到設(shè)定值若使用緩沖鹽流動相,用前和用后均需用水過渡(包括排氣操作)目前二十頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)色譜泵的維護(hù)保養(yǎng)流動相要過濾常用緩沖液時，停泵前要用水清洗泵頭，并用水沖洗柱塞桿清洗孔關(guān)閉排液閥時，不要太用力擰緊，以不滲液為準(zhǔn)更換流動相時，要保證兩種溶劑的互溶性,如不互溶，要用一種中間溶劑過渡色譜泵在停用時,應(yīng)先用水洗去緩沖鹽,然后用純甲醇充滿泵頭及管路,并保存在純甲醇中目前二十一頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)液相色譜系統(tǒng)的清洗與鈍化色譜泵吸濾頭,進(jìn)出口閥及管路(包括進(jìn)樣器和檢測池)若被污染,應(yīng)作清洗和鈍化處理一般采用30％磷酸水溶液作為清洗劑，用6M硝酸作為鈍化劑，先清洗再鈍化清洗的目的是去除不銹鋼管路及系統(tǒng)內(nèi)的污垢鈍化的目的是使不銹鋼管路的內(nèi)表面形成光滑均勻的氧化膜目前二十二頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)色譜泵及系統(tǒng)的清洗清洗液用30%磷酸水溶液30%磷酸配制:取85%濃磷酸35ml與65ml水混勻清洗步驟如下:取下色譜柱，用兩通(Union)連接進(jìn)樣器和檢測器用純水灌注泵頭(四元泵的A,B,C,D四路各為25%)用30%磷酸清洗液洗系統(tǒng)(1ml/min流速)45分鐘(四元泵的A,B,C,D四路各為25%)換成清水洗至出口水pH顯中性用純甲醇過渡，浸潤泵頭及管路，備用目前二十三頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)色譜泵及系統(tǒng)的鈍化鈍化液用6M硝酸水溶液6M硝酸的配制:取濃硝酸40ml與60ml水混勻鈍化步驟如下:在清洗步驟完成后進(jìn)行鈍化處理確認(rèn)清洗用的磷酸已基本洗凈用純水灌注泵頭(四元泵的A,B,C,D四路各為25%)用6M硝酸水溶液鈍化系統(tǒng)(1ml/min流速)45分鐘換成清水洗至出口水pH顯中性用純甲醇過渡，浸潤泵頭及管路，備用目前二十四頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)實驗樣品的制備標(biāo)樣和樣品標(biāo)樣:又稱對照品,它作為液相色譜定性和定量分析的參考標(biāo)準(zhǔn)物,一般是純度較高的純物質(zhì)樣品:待測物,一般是成分復(fù)雜的混合物液相色譜對樣品(包括標(biāo)樣)制備的要求:必須能溶于流動相如樣品的溶劑不是流動相,一定要用流動相試溶解度,以免在進(jìn)樣時樣品在流動相中析出,堵塞管路和色譜柱樣品溶液要過濾除去微粒及雜質(zhì)了解樣品對色譜柱的基質(zhì)/填料是否有破壞作用目前二十五頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)復(fù)雜樣品的預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的除去微粒減少干擾雜質(zhì)濃縮微量的組份提高檢測的靈敏度及選擇性改善分離的效果有利于保護(hù)色譜柱及儀器目前二十六頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)樣品預(yù)處理的重要性是影響實驗成敗的決定性步驟占樣品分析時間的比例最大樣品預(yù)處理所用時間遠(yuǎn)多于色譜分離的時間占分析消耗總成本的比重最大消耗大量的溶劑及其它化學(xué)品對分析結(jié)果的重現(xiàn)性及準(zhǔn)確性影響最大的環(huán)節(jié)影響實驗結(jié)果好壞的最重要因素目前二十七頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)樣品預(yù)處理常用的方法高速離心取上清液過濾、超濾選擇性沉淀衍生反應(yīng)液-液萃取固相提取(SolidPhaseExtract,SPE)Oasis和Sep-Pak固相提取小柱其它目前二十八頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)去除微粒的方法過濾過濾膜/過濾裝置有機(jī)濾膜(≤0.5μm)/水溶性濾膜(≤0.45μm)膜片可更換一次性使用的膜“Cartridge”使用方便簡單，交叉污染小有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品的處理高速離心大于：10,000rpm目前二十九頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)超濾機(jī)理超濾是一種基于分子量分離的技術(shù)目的根據(jù)分子量的不同把分子、細(xì)胞及病毒等分為不同的餾份除去小分子樣品中的大分子蛋白脫鹽目前三十頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)選擇性沉淀常用于生化樣品中除蛋白有機(jī)溶劑乙腈，甲醇強(qiáng)酸三氯乙酸，高氯酸鹽50%硫酸銨10%TCA(三氯乙酸鈉)目前三十一頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)樣品衍生提高檢測的靈敏度增加紫外基團(tuán)以增強(qiáng)紫外檢測的靈敏度增加熒光基團(tuán)以便使用高靈敏度熒光檢測器改變分離的選擇性改變組份的基團(tuán)，如：變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離典型的例子柱前衍生氨基酸分析目前三十二頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)AccQ-Tag衍生法NNOHOONO+NOR1R2HNNOOOHNH20NH2NOOOHN++AQC衍生試劑１°及２°氨基酸衍生后的氨基酸CO2N-羥基琥珀酰亞胺N-羥基琥珀酰亞胺半衰期＜1秒半衰期約15秒6-氨基喹啉目前三十三頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)濃縮樣品目的：富集微量或痕量組份濃縮樣品的方法萃取/吹干沉淀/再溶解色譜法固相提取

Oasis小柱

Sep-Pak小柱目前三十四頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)OasisHLB固相提取小柱親水-親脂平衡共聚物“親水”使填料具有水可浸潤性質(zhì)降低與水的接觸角“親脂”提供對被分析物質(zhì)的反相保留能力NO親水性單體∶N-乙烯基吡咯烷酮親脂性單體∶

二乙烯基苯目前三十五頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)活化/平衡1ml甲醇/1ml水上樣多至200ml樣品沖洗廢棄物1ml5%甲醇/水溶液洗脫想要的化合物1ml甲醇揮發(fā)溶劑并重新定容制備樣品這是適合于分析眾多基質(zhì)中大多數(shù)樣品的通用操作步驟建議首先使用這種通用的操作步驟如果需要進(jìn)一步降低干擾物的影響，可使用二維SPE方法注:此方法于規(guī)格為3cc,60mg的Oasis?HLB小柱上開發(fā)樣品預(yù)處理的通用SPE方法目前三十六頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)SPE處理的效果目前三十七頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)進(jìn)樣器的使用進(jìn)樣器的種類:手動進(jìn)樣器－7725i自動進(jìn)樣器－717Plus，2695樣品管理系統(tǒng)進(jìn)樣器與系統(tǒng)的連接：進(jìn)樣器的入口與色譜泵的出口相連進(jìn)樣器的出口與色譜柱的入口相連要求：出入口方向不能接錯，接頭不能留有空隙進(jìn)樣器的連接管路：出口管路一定要用細(xì)管(內(nèi)徑≤0.009″),長度要短,盡量減少譜帶擴(kuò)展目前三十八頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)手動進(jìn)樣器的使用7725i手動進(jìn)樣器的進(jìn)樣方式:固定體積進(jìn)樣:進(jìn)樣量取決于Loop的體積可變體積進(jìn)樣:進(jìn)樣量由微量注射器量取注意:固定體積進(jìn)樣需要用超過Loop體積5-10倍的樣品量進(jìn)樣,以保證進(jìn)樣濃度不被稀釋可變體積進(jìn)樣在注射器注入樣品后,應(yīng)盡快將進(jìn)樣器扳至Inject位置,以避免樣品在Loop中的擴(kuò)散進(jìn)樣器的清洗:每次進(jìn)樣前應(yīng)將微量注射器清洗干凈,防止樣品間交叉污染,影響實驗結(jié)果目前三十九頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)自動進(jìn)樣器的使用自動進(jìn)樣器(717Plus和2695樣品管理系統(tǒng)):樣品瓶位置和進(jìn)樣量由軟件設(shè)定注意:樣品瓶中應(yīng)有超過1／3瓶高度的樣品量使用內(nèi)襯管(Insert)時應(yīng)設(shè)定針高度為2mm(2695)或75%高度(717Plus)進(jìn)樣器的清洗:進(jìn)樣針是流路的組成部分,運(yùn)行中一直由流動相清洗進(jìn)樣針外部由軟件控制在每次進(jìn)樣前用洗針液清洗若注射器內(nèi)出現(xiàn)氣泡，用面板操作的PurgeInject功能清除之目前四十頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)自動進(jìn)樣器的洗針液注意∶洗針溶劑瓶(內(nèi)放綠色塑料管)不要放在儀器的上部，應(yīng)放于與儀器同一水平面的實驗臺上洗針溶劑根據(jù)流動相的不同應(yīng)有不同：目前四十一頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)檢測器的啟動操作連通流路：色譜柱出口接檢測器入口注意接頭不要留有空隙連接管路要用細(xì)管(≤0.009″)檢測器出口用適當(dāng)?shù)墓苈?內(nèi)徑,長度)通向廢液瓶連通數(shù)據(jù)線路:IEEE電纜(對大多數(shù)檢測器)與軟件busLAC/E卡連接手動進(jìn)樣器的啟動信號線與檢測器背板上的InjectStart接口連接開啟電源開關(guān)后,需待檢測器通過自檢后,才能被軟件控制(約需5-10分鐘)通流動相平衡至少30分鐘后才能正常工作目前四十二頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)Waters2487檢測器目前四十三頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)2487的顯示屏幕通道吸光度燈開/關(guān)波長靈敏度下一畫面運(yùn)行時間(分)自控/遙控診斷開/關(guān)鍵盤鎖開/關(guān)單/雙波長Shift開/關(guān)AUFS(AbsorbanceUnitFullScale):滿量程吸光度單位目前四十四頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)2487的面板及操作回車鍵分屏顯示鍵選項移動鍵主屏幕方法調(diào)用，A/B通道切換設(shè)置及診斷單/雙波長，自動調(diào)零運(yùn)行/停止鍵第二功能鍵監(jiān)視色譜圖屏幕對比度目前四十五頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)Waters2996PDA檢測器PDA(PhotoDiodeArray):光電二極管矩陣目前四十六頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)由軟件設(shè)定檢測器參數(shù)只需設(shè)定如下參數(shù)即可采集數(shù)據(jù)波長范圍分辨率每秒采集的光譜數(shù)操作極為簡便不需費(fèi)神選擇參比波長及其帶寬目前四十七頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)Waters2414示差折光檢測器目前四十八頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)2414的顯示屏幕沖洗參比池折射率極性RIU量程檢測器溫度下一畫面運(yùn)行時間(分)自控/遙控鍵盤鎖開/關(guān)模式Shift目前四十九頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)2414的面板及操作回車鍵屏幕對比度選項移動鍵主屏幕方法調(diào)用，溫度設(shè)置自動調(diào)零運(yùn)行/停止鍵第二功能鍵監(jiān)視色譜圖沖洗參比池設(shè)置及診斷下一頁目前五十頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)2414檢測器的日常操作設(shè)定檢測器內(nèi)、外(如有柱溫箱)溫度以5ml/min的流速“purge”參比池五分鐘不接色譜柱！參數(shù)設(shè)置按文獻(xiàn)值或?qū)嶒灈Q定至少需要2小時以上的平衡時間通常檢測器可以在白天結(jié)束工作后不關(guān)機(jī)，保持0.1到0.5ml/min的流速循環(huán)沖洗樣品池和參比池,可節(jié)省第二天的平衡時間目前五十一頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)使用示差檢測器的注意事項不能做梯度實驗最大的池耐壓是100psi注意保持出口管路的暢通流速范圍是0.1-10ml/min此種類型檢測器是壓力敏感和溫度敏感型檢測器注意保持泵壓力的平穩(wěn)注意環(huán)境溫度的恒定目前五十二頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)Waters2475熒光檢測器目前五十三頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)2475檢測器的特點(diǎn)可調(diào)波長熒光檢測器雙掃描在掃描模式下(Scan)發(fā)射波長及激發(fā)波長均可掃描高靈敏度∶水的RAMAN峰S/N大于200可編程時間-波長時間-增益由RS232串行口或網(wǎng)線與計算機(jī)相連目前五十四頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)2475的主顯示屏發(fā)射/能量燈開/關(guān)下一頁運(yùn)行時間(分)面板/軟件控制鍵盤鎖/開Shift開/關(guān)單/多波長通道選擇增益波長診斷鍵開/關(guān)靈敏度目前五十五頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)2475的面板及操作回車鍵分屏顯示鍵選項移動鍵主屏幕方法調(diào)用，通道切換設(shè)置／診斷自動調(diào)零運(yùn)行/停止鍵第二功能鍵監(jiān)視色譜圖開／關(guān)燈屏幕亮度調(diào)節(jié)光譜掃描目前五十六頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)2475熒光檢測器的掃描功能掃描功能

由面板功能執(zhí)行Empower

英文版亦能由軟件執(zhí)行目前五十七頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)熒光檢測器使用注意事項不是所有化合物都有熒光，有時需要衍生檢測器對溶解氣體及其它“淬滅”物質(zhì)(如甲醇)敏感,流動相最好能在線脫氣對Ex及Em的最佳，易受溫度、溶劑極性和粘度、pH及樣品濃度影響檢測池的耐壓較低,注意出口管路要暢通設(shè)置的發(fā)射波長至少要比激發(fā)波長高10nm目前五十八頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)流動相脫氣與否的信號比較MinutesColumn- WatersPAHColumn, @27oCEluentA: WaterEluentB: AcetonitrileGradient: 60%Bto100%Busing curve9in12minutes Hold11minutes BacktoinitialconditionsFlowRate 1.2ml/minInjection: 20ul Timeprogrammed wavelengthchanges20.521.022.01000MV脫氣未脫氣Breeze?withFluorescence1231.Benzo(b)flouranthene–400ppb2.Benzo(k)fluoranthene-200ppb3.Benzo(a)pyrene-200ppb目前五十九頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)樣品濃度對激發(fā)和發(fā)射波長的影響發(fā)射激發(fā)~10–3M~10–5M在庚烷中目前六十頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)檢測器的使用和保養(yǎng) 如長時間不用檢測器可以關(guān)掉光源燈(UV,FL)僅在4小時以上不用時,才需關(guān)燈頻繁開關(guān)燈也會影響燈壽命不要讓緩沖液長期停滯在檢測池內(nèi)用純水沖洗保存在純甲醇中示差檢測器及熒光檢測器若與其它檢測器串聯(lián)使用,應(yīng)將此兩種檢測器串在其它檢測器的后面不用檢測器的液晶顯示屏?xí)r，應(yīng)將其亮度調(diào)暗目前六十一頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)Waters中國有限公司培訓(xùn)中心液相色譜教程

(四)

液相色譜柱基礎(chǔ)知識

目前六十二頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)液相色譜柱基礎(chǔ)知識

(3)反相色譜柱的選擇Waters中國有限公司培訓(xùn)中心目前六十三頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)液相色譜柱與分離機(jī)理的關(guān)系從色譜方法上分正相/反相離子交換分子體積排除親合疏水回受從柱子類型上分分配/吸附離子交換凝膠親合目前六十四頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)對HPLC色譜柱的要求(1)合適的選擇性滿足不同的分離要求良好的色譜峰形重現(xiàn)性寬應(yīng)用范圍目前六十五頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)硅膠基質(zhì)C18填料都相同嗎？色譜實驗結(jié)果揭示：疏水性不同殘留硅羥基活性不同為什么？不同

C18配體鍵合水平（狀況）配體覆蓋率不同硅膠顆粒基質(zhì)密度，表面積，孔徑純度目前六十六頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)色譜柱品牌名稱不同色譜柱“品牌名稱”表示不同的硅膠基質(zhì)WatersSymmetry?C18WatersNova-Pak?C18相同的“品牌名稱”,不同的配體表示相同的硅膠基質(zhì)，鍵合相不同WatersSymmetry?C18WatersSymmetry?C8注意：由于硅羥基的影響，許多情況下硅膠基質(zhì)對整個鍵合相的性能起決定作用目前六十七頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)Minutes04812162024YMC-Pack?ProC18?YMC-Pack?ProC4?二氫苊萘對羥基苯甲酸丁酯提示:相似的選擇性歸因于相同的硅膠基質(zhì)(同一品牌,不同鍵合相)配體不同的影響：C18與C4目前六十八頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)品牌不同的影響:(相同配體)分45678910YMC-Pack?ODS-AQ?YMC-Pack?ProC18?酮洛芬痛滅定萘普生舒洛芬舒洛芬

萘普生酮洛芬和痛滅定注意:由于硅膠顆?；|(zhì)不同(品牌不同),分離的選擇性不同目前六十九頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)01020304050用于浸潤固定相的甲醇水溶液的比例%020406080100在1mL/min流速下的浸潤率%C18鍵合相硅膠柱填料需要

合適的濕潤度注意：需要有機(jī)溶劑來保證反相填料有合適的濕度,反之停流速后易出現(xiàn)“疏水塌陷”問題目前七十頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)未濕潤的孔濕潤的孔注意：保留時間與填料表面積與配體有關(guān)。然而，如果硅膠表面未濕潤，那么有效的色譜表面積會減少95%，因此，減少被分析物的保留時間即等于“疏水塌陷”，記?。簬缀跛械谋砻娣e都在孔內(nèi)！低比例有機(jī)溶劑或純水溶液流動相C18硅膠什么是“疏水塌陷”？目前七十一頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)分0246810流動相：0.1%醋酸水溶液阿莫西林Vo：被分析物沒有保留“濕潤時”“去濕后”Symmetry?C8：疏水塌陷目前七十二頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)停流速后(孔去濕:~3%)流動相：0.1%醋酸水溶液Minutes0246810初始時保留時間無變化阿莫西林SymmetryShield?RP8：

無疏水塌陷現(xiàn)象發(fā)生內(nèi)嵌極性基團(tuán)鍵合相：使用高比例水溶液流動相時色譜性能穩(wěn)定目前七十三頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)帶有極性基團(tuán)的反相色譜填料目前七十四頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)內(nèi)嵌極性基團(tuán)配體:可能機(jī)理-極性基團(tuán)增加了填料表層水的濃度降低堿性物質(zhì)的保留減少了拖尾改善與水的浸潤性屏蔽了帶負(fù)電的硅羥基目前七十五頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)水表面層機(jī)理水“屏蔽”層降低了堿性化合物的保留降低了拖尾現(xiàn)象屏蔽了帶負(fù)電的硅羥基目前七十六頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)SymmetryShield?RP18TfUSP=1.1分0102030阿米替林Symmetry?C18TfUSP=1.9注意：對堿性化合物而言，可以減少保留時間并且改善色譜峰形相同硅膠基質(zhì)(配體不同)內(nèi)置極性基團(tuán)的配體與直鏈烷烴配體的比較目前七十七頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)注:使用相同的流動相SymmetryShield?RP8Symmetry?C8選擇性不同呋喃唑酮(痢特靈)雜質(zhì)分析目前七十八頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)色譜柱選擇性比較表(ln[k]二氫苊)Hypersil?BDSC18Symmetry?C18Inertsil?ODS-2Inertsil?ODS-3Kromasil?C18YMC-Pack?ProC18?YMC-Pack?ODS–AQ?Nova-Pak?C18Hypersil?ODSYMCJ'sphere?ODS–H80YMCJ'sphere?ODS–M80Nucleosil?C18μBondapak?C18YMCJ'sphere?ODS–L80WatersSpherisorb?ODS1Resolve?C18WatersSpherisorb?ODS2-0.20.30.81.31.82.32.811.522.533.5疏水性增加硅羥基活性降低(ln[a]阿米替林/二氫苊)選擇性變化目前七十九頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)對HPLC色譜柱的要求(2)合適的選擇性良好的色譜峰形定量精度、靈敏度與分離度重現(xiàn)性寬應(yīng)用范圍目前八十頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)USP拖尾因子（TailingFactor）:

Tf＝不對稱因子(AssymmetryFactor):

As＝ab峰高之5%處色譜峰對稱性的衡量方法abab)(a2+目前八十一頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)對稱峰形的益處更準(zhǔn)確與精確的定量結(jié)果純度分析穩(wěn)定性分析更高的靈敏度

更好的檢出限與定量限（LOD和LOQ）對低濃度雜質(zhì)有更強(qiáng)的檢測能力更好的分離度更有利于相鄰色譜峰的分離目前八十二頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)99.6%99.8%99.9%峰面積回收率T=1.00Waters21,379由于拖尾引起的積分誤差92.3%95.3%97.8%T=1.58峰面積回收率目前八十三頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)由于拖尾引起的靈敏度差異

他莫昔芬0.25g/mL信噪比11.06.5AUSymmetryC18AU5.0010.00MinutesConventionalC18目前八十四頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)峰形對分離度的影響Rs=(t峰2–t峰1)/0.5(w4.4%

峰1+w4.4%

峰2)=(11.5-10.6)/0.5(2.0+0.5)=0.72Minutes0510152025提示:基線分離的分離度

=1.5目前八十五頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)不同填料的峰形比較1.二羥基丙酮2.心得安(T=1.0)3.二氫苊4.阿米替林(T=1.6)1.二羥基丙酮2.心得安(T=5.7)3.二氫苊4.阿米替林(T=7.0)AlltimaC8SymmetryC8目前八十六頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)具有良好峰形的Symmetry柱建立高效液相色譜柱的新標(biāo)準(zhǔn)，開創(chuàng)新一代高品質(zhì)色譜柱全新的標(biāo)準(zhǔn)：在很寬的pH范圍下，對酸、堿及中性化合物均有非常好的色譜峰形極高的批間重現(xiàn)性獨(dú)特的選擇性良好的柱壽命目前八十七頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)對HPLC色譜柱的要求(3)合適的選擇性良好的色譜峰形重現(xiàn)性色譜柱間重現(xiàn)性批次間重現(xiàn)性寬應(yīng)用范圍目前八十八頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)色譜柱重現(xiàn)性的重要性重現(xiàn)性是液相色譜分析的基本要求缺乏重現(xiàn)性是用戶最擔(dān)心的問題加快方法驗證(Validation)的速度更容易傳遞方法色譜系統(tǒng)之間以及實驗室之間確保長期符合認(rèn)證及系統(tǒng)適應(yīng)性等要求更容易符合法規(guī)要求目前八十九頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)同一批次合成的填料—色譜柱之間的重現(xiàn)性柱床填充質(zhì)量控制塔板數(shù)色譜峰對稱性反壓無選擇性差異不同批次合成的填料—色譜柱批次間重現(xiàn)性顆粒的物理性質(zhì)表面之化學(xué)性質(zhì)柱間重現(xiàn)性與批次間重現(xiàn)性的區(qū)別目前九十頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)Symmetry—優(yōu)異的重現(xiàn)性不同產(chǎn)品批號間的差別最低，充分滿足各種嚴(yán)格的cGMP要求孔徑 RSD=3%滲透性 RSD=2%特征表面積 RSD=2%平均顆粒度 RSD=2%目前九十一頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)不同批次間重現(xiàn)性Symmetry?C18品牌B品牌CSymmetry?C18–45批目前九十二頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)紫杉醇中的不純物分析:三批色譜柱所得色譜重疊圖色譜柱:Symmetry

C83.5m(4.6x100mm)8

流速:1.8mL/min流動相:甲醇/乙腈/水9:34:57檢測波長:UV230nm樣品:25Lof1mg/mL紫杉醇0.0010.0020.0030.00Minutes

不同批次間重現(xiàn)性目前九十三頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)Symmetry?色譜柱優(yōu)點(diǎn)優(yōu)異的色譜峰形無可比擬的重現(xiàn)性所認(rèn)證的方法置信度高容易達(dá)到法規(guī)要求認(rèn)證方法的長期穩(wěn)定性有利于長期符合法規(guī)要求目前九十四頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)對HPLC色譜柱的要求(4)合適的選擇性良好的色譜峰形重現(xiàn)性寬應(yīng)用范圍pH

范圍溫度范圍目前九十五頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)pH對填料穩(wěn)定性的影響高pH實驗pH>8時,許多C18硅膠基質(zhì)過早地喪失柱效由于填料顆粒溶解,色譜柱內(nèi)產(chǎn)生空隙隨著鍵合相覆蓋率的增加，色譜柱壽命延長低pH實驗pH<2時,許多C18硅膠基質(zhì)過早地喪失柱效由于鍵合相之水解作用,被測物喪失保留行為使用三官能團(tuán)鍵合相可獲得最佳的穩(wěn)定性目前九十六頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)XTerra色譜填料Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane(MPEOS)Methyltriethoxysilane(MTEOS)雜化顆粒合成(Hybridparticlesynthesis)同時含有有機(jī)和無機(jī)組分擁有介于有機(jī)與無機(jī)材料之間的性質(zhì)Xterra:Waters創(chuàng)新的雜化填料目前九十七頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)0102030400123456789101112pHXTerra?色譜柱硅羥基電離硅羥基不電離

弱保留

好峰形保留增加好色譜峰形必須嚴(yán)格控制pH方可獲得良好色譜重現(xiàn)性pH10

去甲替林阿米替林Minutes0123Minutes0123pH2保留最強(qiáng)

好色譜峰形改善色譜重現(xiàn)性保留因子(k)堿性化合物在不同pH條件下的分離度目前九十八頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)靈敏度與選擇性的改變色譜柱:XTerra?RP18,4.6.x150mm,3.5μm檢測:254nm(相同進(jìn)樣量)流動相:50%乙腈/40%水/10%含100mM

CAPSO,

pH10流動相:30%乙腈/60%水/10%含100mM磷酸鈉,

pH2.0MinutespH100.000.2524681012酮康唑阿司咪唑0酮康唑阿司咪唑AUpH2色譜圖重疊pH2與10：阿司咪唑與酮康唑分析目前九十九頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)簡化方法開發(fā)過程123456789101112pH中間pH硅膠柱低pH硅膠柱高pH聚合物基質(zhì)柱寬pH范圍XTerra?填料色譜柱XTerra?色譜柱之寬pH范圍(以一當(dāng)三)目前一百頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)溫度pHXTerra?填料：高溫穩(wěn)定性目前一百零一頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)Xterra:高溫壽命試驗PeakNumber

USPTailingFactor1.多慮平1.22.去甲替林1.13.阿米替林1.14.三甲丙咪嗪1.0AU-0.0050.10Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00AU-0.020.48Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.001234123412341234AU0.000.26Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00AU-0.0050.10Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00第二十一天第二天XTerra?RP18普通硅膠C18

Conditions:Column:XTerra?RP18,5μm,4.6X150mmMobilePhase:40%pH7,10mMNa2PO4,60%ACNColumnTemp.:60°CFlowRate:1.5mL/minDetector:254nm三環(huán)抗抑郁藥物分離目前一百零二頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)Xterra色譜柱的優(yōu)點(diǎn)XTerra色譜柱為方法開發(fā)提供了極其有效且方便的工具寬pH范圍良好色譜峰形高穩(wěn)定性高速度WatersPatentTechnology2000R&D100AwardWinner目前一百零三頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)最新研制的Atlantis反相柱目前一百零四頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)新型AtlantisTM填料的性質(zhì)提高極性物質(zhì)保留能力的同時，改善常規(guī)反相色譜性能雙官能團(tuán)鍵合C18(dC18)端基封口平均孔徑為100?顆粒度：3,5及10m

目前一百零五頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)新型AtlantisTM填料的特點(diǎn)對極性與非極性化合物的優(yōu)異保留特性在100％水溶液流動相中運(yùn)行保持色譜性能穩(wěn)定峰形優(yōu)異超低鍵合相流失，質(zhì)譜兼容酸性條件下穩(wěn)定性良好雙鍵鍵合C18，使之：具有較長的色譜柱壽命低pH條件下穩(wěn)定性增強(qiáng)極佳的色譜柱間重現(xiàn)性目前一百零六頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)同時分離極性與非極性化合物極性化合物在AtlantisTM色譜柱上保留較強(qiáng)，而非極性物質(zhì)在其上的保留時間與常規(guī)C18色譜柱相似。12345109876V0=0.98minTime(Min)1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.00ConditionsColumn:AtlantisTM4.6x150mm,5μmMobilePhaseA:H2OMobilePhaseB:ACNMobilePhaseC:100mMNH4COOH,pH3.0Flowrate:2.0mL/minGradient:TimeProfile(min)%A%B%C0.008010

1010.0095515.00955Injectionvolume:5.0μLTemperature:30oCDetection:UV@254nmCompounds1.Uracil2.Acetanilide3.Triamcinolone4.Hydrocortisone5.2-Amino-7-chloro-5-oxo-5H-[1]-benzopyrano-[2,3-b]pyridinecarbonitrile6.6a-Methyl-17a-hydroxyprogesterone7.3-Aminofluoranthene8.2-Bromofluorene9.Perylene10.Naphthol[2,3-a]pyrene目前一百零七頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物12345109876Time(Min)2.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.00V0=1.83min化合物:1.去甲腎上腺素(NE)2.腎上腺素(E)3.3,4-二羥基苯基丙氨酸(DOPA)4.多巴胺(DA)5.3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇(MHPG)6.4-羥基-3-甲氧基苯基乙醇酸(VMA)7.5-羥色胺(5-HT)8.3,4-二羥基苯乙酸(DOPAC)9.5-羥基-3-吲哚乙酸(5HIAA)10.4-羥基-3-甲氧基苯乙酸(HVA)條件色譜柱: 4.6x150mm,5μm流動相A: H2O流動相B: ACN流動相C: 100mMNH4COOH,pH3.0流速 1.0mL/min梯度: 時間 流動相組成 (min) %A%B%C 0.00 90010 5.00 90010 15.0 652510 20.0 652510進(jìn)樣體積: 10μL溫度: 30oC檢測: UV@280nm目前一百零八頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)水溶性維生素(Vitamins)化合物:

USP拖尾因子1.L-抗壞血酸(Vc) 1.122.煙酸 1.273.硫胺(VB1) 1.204.吡哆醛 1.135.VB6 1.046.葉酸 1.107.咖啡因 1.108.核黃素(VB2) 1.14Time(Min)1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0012345876V0=1.37min條件色譜柱:4.6x150mm,5μm流動相A:0.1%TFA流動相B:乙腈流速:1.4mL/min梯度: 時間 流動相組成 (min) %A%B 0.0 1000 4.0 973 6.0 8515 15.0 8020進(jìn)樣體積:10.0μL溫度:30oC檢測:UV@260nm目前一百零九頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)反相色譜柱的選擇小結(jié):(1)常規(guī)應(yīng)用現(xiàn)代高純硅膠色譜柱：SymmetryShield/Symmetry優(yōu)點(diǎn)：峰形好，重現(xiàn)性高，壽命長限制：pH2-8流動相中含有大量水溶液采用Shield技術(shù)：XTerraRP或SymmetryRP填料Atlantis填料技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：在含有大量水溶液（100％水溶液）流動相中性能穩(wěn)定：峰形好目前一百一十頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)需要使用寬pH值或高溫條件－如生物堿分離XTerra雜化顆粒技術(shù)：pH1-12優(yōu)點(diǎn)：pH范圍寬，高溫條件下填料穩(wěn)定性好，色譜峰形好，壽命長采用質(zhì)譜檢測器:窄內(nèi)徑/小顆粒/短柱XterraMSC18AtlantisSymmetryC18反相色譜柱的選擇小結(jié):(2)目前一百一十一頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)需要提高極性物質(zhì)的保留常規(guī)pH：AtlantisdC18極端pH：Xterra：如堿性化合物需要分析分子量較大的多肽或蛋白Symmetry300C18C4反相色譜柱的選擇小結(jié):(3)目前一百一十二頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)結(jié)論各種品牌的C18柱皆有各自不同的選擇性目前一百一十三頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)液相色譜教程

(七)

液相色譜常見問題分析Waters中國有限公司培訓(xùn)中心目前一百一十四頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)色譜圖常見問題色譜圖常見問題主要有三類:色譜峰峰形異常問題例如負(fù)峰,寬峰,肩峰,雙峰,峰形不對稱等色譜圖中多峰少峰問題色譜圖未出峰,出峰比預(yù)想的多等色譜峰保留時間問題保留時間不穩(wěn)定等目前一百一十五頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)色譜圖常見問題分析(一)色譜峰峰形異常問題:所有的峰均為負(fù)峰:信號電纜接反或檢測器輸出極性設(shè)置顛倒光學(xué)裝置尚未達(dá)到平衡一個或幾個峰是負(fù)峰流動相吸收本底高進(jìn)樣過程中進(jìn)了空氣離子對分離中的系統(tǒng)峰樣品組分的吸收(RI或UV)低于流動相目前一百一十六頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)色譜圖常見問題分析(一)色譜峰峰形異常問題:所有的峰都是寬峰系統(tǒng)未平衡或未達(dá)到化學(xué)平衡溶樣的溶劑比流動相強(qiáng)很多色譜柱類型或尺寸不正確色譜柱或保護(hù)柱被污染或降級溫度變化對色譜柱的影響目前一百一十七頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)色譜圖常見問題分析(一)色譜峰峰形異常問題:較早洗脫的峰呈寬峰進(jìn)樣體積過大或樣品濃度太高進(jìn)樣器有問題,定量環(huán)(Loop)大小不合適在線過濾器,保護(hù)柱,色譜柱或管路堵塞管路問題:內(nèi)徑不對或切管不正確管路連接問題:接頭或錐箍不正確檢測器時間常數(shù)不正確目前一百一十八頁\總數(shù)一百三十七頁\編于十七點(diǎn)色譜圖常見問題分析(一)色譜峰峰形異常問題:峰比預(yù)想的要小樣品粘度過大進(jìn)樣器有問題或進(jìn)樣體積有誤檢測器設(shè)置不正確,定量環(huán)(Loop)體積不正確檢測器輸出未置零用了不正確的檢測器