硫酸軟骨素的精制與純化

關(guān)于硫酸軟骨素的精制與純化第1頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、純化的原因和意義二、提取過(guò)程中常用的純化手段三、乙醇沉淀法在純化中的應(yīng)用四、乙醇與纖維素柱分級(jí)相結(jié)合的純化應(yīng)用五、季銨鹽在純化中的應(yīng)用六、季銨鹽與其他手段的結(jié)合在純化過(guò)程中的應(yīng)用七、鹽溶液沉淀法八、離子交換法在純化中的應(yīng)用第2頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、純化的原因和意義第3頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月硫酸軟骨素在組織中的存在形式第4頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月除透明質(zhì)酸外，蛋白聚糖是糖胺聚糖的天然存在形式，因此，組織消化液中會(huì)殘留大量蛋白質(zhì)及肽類(lèi)；而在同一組織中，可能存在多種蛋白聚糖，后者又可能含有多種糖胺聚糖，而即便是同一糖胺聚糖，也可存在多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型，因此，對(duì)經(jīng)提取后的糖胺聚糖進(jìn)行分級(jí)分離，是獲得單一糖胺聚糖的必經(jīng)之路。第5頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月硫酸軟骨素類(lèi)型二糖重復(fù)單元來(lái)源AGlcA-GalAc4S牛軟骨BIdoA2S-GalNAc皮膚CGlcA-GalNAc6S鯊魚(yú)軟骨DGlcA2S-GalNAc6S海膽EGlcA-GalNAc4,6S烏賊第6頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蛋白聚糖核心蛋白（kDa)糖鏈數(shù)組織部位聚集蛋白聚糖208～220～100軟骨多功能蛋白聚糖26512～15纖維母細(xì)胞神經(jīng)蛋白聚糖1451～2腦短小蛋白聚糖96～4腦飾膠蛋白聚糖361結(jié)締組織二糖鏈蛋白聚糖381～2結(jié)締組織Bamacan1381～3基底膜Α-2(1X）膠原681軟骨、玻璃體液血栓調(diào)節(jié)蛋白聚糖581內(nèi)皮細(xì)胞CD44371～4淋巴細(xì)胞、膜NG22512～3神經(jīng)細(xì)胞、膜絲甘蛋白聚糖10～1910～15脊髓細(xì)胞第7頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分離純化的一般要求純度：主要取決于純化的目的和應(yīng)用的要求，一般醫(yī)藥工業(yè)并不一定要求產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的絕對(duì)均一，只要達(dá)到一定純度即可活性：要求大分子保持天然構(gòu)型狀態(tài)，并具有高度的生物活性收率：希望收率越高越好，但在純化過(guò)程中損失往往是不可避免的，而且純化步驟越多，損失越大第8頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月純化的意義純化是獲取糖鏈結(jié)構(gòu)信息、探索其生物學(xué)功能及變化的前提純度是商品內(nèi)在價(jià)值重要體現(xiàn)，純化是提高單位原料（如軟骨）產(chǎn)出的手段純化是減少過(guò)敏原的重要途徑雜質(zhì)的減少，可以有效改善產(chǎn)品色澤及其他感官品質(zhì)第9頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、提取過(guò)程中的常用的純化手段第10頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月由于硫酸軟骨素在組織中以蛋白聚糖的形式存在，因此，在提取過(guò)程中，組織經(jīng)蛋白酶消化釋放所有多糖后，消化液中仍會(huì)保留大小不同的蛋白和肽類(lèi)物質(zhì)，這類(lèi)物質(zhì)雖可在隨后的純化過(guò)程中予以去除，但在提取過(guò)程中去除越充分，則越有利于進(jìn)一步純化。第11頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三氯乙酸沉淀法磷鉬酸磷鎢酸沉淀法氯仿-丁醇/氯仿-戊醇沉淀法活性炭、Fuller’s、硅酸鋁、高嶺土吸附法等電點(diǎn)沉淀法超濾法第12頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月硫酸軟骨素的主要純化手段組織中的硫酸軟骨素經(jīng)堿解和/或蛋白酶水解后，提取液中可能存在各種糖胺聚糖和許多雜質(zhì)如脂類(lèi)、蛋白或肽類(lèi)、色素以及無(wú)機(jī)鹽等共存，因此必須采取合適的方法進(jìn)行去除。純化主要包括不同糖胺聚糖之間的分離，以及非糖胺聚糖類(lèi)物質(zhì)的分離常用的分級(jí)分離方法主要利用各種糖胺聚糖之間、以及硫酸軟骨素與其他雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中溶解度的不同或者電荷密度的差異，分別采用乙醇沉淀法、鹽液沉淀法、季胺鹽絡(luò)合法與離子交換色譜法等。第13頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、乙醇沉淀法在純化中的應(yīng)用第14頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月乙醇沉淀法既可以回收糖胺聚糖，也是一種簡(jiǎn)便的純化方法軟骨消化液，加入1.25倍體積的乙醇，即可沉淀近乎純品的硫酸軟骨素，而硫酸角質(zhì)素和部分硫酸軟骨素則保留在清液中一組性質(zhì)相似的糖胺聚糖(如硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C及硫酸角質(zhì)素），往往無(wú)法用季胺鹽分開(kāi)，則可以采用乙醇分級(jí)沉淀予以分離第15頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分級(jí)沉淀時(shí)，每次加入的乙醇應(yīng)視混合糖各成分的性質(zhì)差異而定，通常級(jí)差益大些如已知或懷疑消化液中含有硫酸角質(zhì)素，則益加大過(guò)量的乙醇以豬皮中硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素分離為例，混合物先后通過(guò)18%、25%、40%、50%等乙醇濃度進(jìn)行依次分離，其中硫酸角質(zhì)素在前兩濃度下沉淀，而硫酸軟骨素則在高濃度下沉淀第16頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月粗消化液中所得的乙醇沉淀，?；煊须s質(zhì)，利用水溶液或鹽溶液進(jìn)行復(fù)溶與沉淀，可以去除部分雜質(zhì)，如部分變性蛋白重新溶解困難，可以離心去除第17頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、乙醇與纖維素柱結(jié)合的純化應(yīng)用第18頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月混合多種糖胺聚調(diào)成分的硫酸軟骨素溶液，采用乙醇沉淀往往需要幾次反復(fù)才能獲得良好的分離效果，如果各成分間的醇沉濃度差別不大、或者樣品濃度較小時(shí)，則難度更大以多孔的化學(xué)惰性的纖維素柱為介質(zhì)，繼而以濃度逐步降低的乙醇進(jìn)行洗脫，則可以克服上述醇沉的諸多不足第19頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月椎間盤(pán)髓核中硫酸軟骨素及硫酸角質(zhì)素的純化纖維素裝柱平衡提取液上柱乙醇梯度洗脫50%乙醇洗脫液25%乙醇洗脫液硫酸角質(zhì)素硫酸軟骨素第20頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月五、季銨鹽絡(luò)合法在純化中的應(yīng)用第21頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月硫酸軟骨素可以與一些陽(yáng)離子洗滌劑如氯化十六烷基吡啶(CPC）和氯化十六烷基三甲銨（CTAB）形成沉淀，該沉淀又可在一定無(wú)機(jī)鹽臨界濃度下解離。各種糖胺聚糖分子中可電離集團(tuán)的位置、數(shù)量及連接方式的差異，使其與季胺基的親和力不同，因此，使用不同濃度的鹽可以將發(fā)生結(jié)合的糖胺聚糖陰離子分別取代下來(lái)，各種糖胺聚糖的最低解離鹽濃度各有不同，據(jù)此可以將不同糖胺聚加以分離，從而使硫酸軟骨素得以純化第22頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月以下關(guān)于CPC的應(yīng)用，大多同樣適用于CTABCPC的質(zhì)量各生產(chǎn)廠家有較大差異，如有必要，可以用水或丙酮重結(jié)晶予以純化CPC水溶液在260nm有強(qiáng)烈吸收，因此本身也是一種靈敏而簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法CPC可配制成1～10%的水溶液糖的最適濃度在0.1～1%每沉淀一份糖可用三份CPC，最終混合液中游離CPC應(yīng)不低于0.05%第23頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CPC復(fù)合物中硫酸軟骨素的回收CPC硫酸軟骨素復(fù)合物需要經(jīng)解離方可回收硫酸軟骨素，方法主要有以下三種1、復(fù)合物溶于鹽溶液：用小于4mol/L的氯化鈉，在40oC下不斷攪拌解離，解離后加入3～5倍體積乙醇，硫酸軟骨素沉淀析出，或向解離液中加入碘鹽或硫氰酸鹽，以去除季銨鹽離子；解離液中的季銨鹽離子也可用有機(jī)溶劑抽提去除第24頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、季銨鹽-硫酸軟骨素復(fù)合物溶于有機(jī)溶劑：將復(fù)合物先經(jīng)水洗滌除去無(wú)機(jī)鹽后，37oC下加入丙酮或乙醇，所得溶液用不能溶于上述溶劑的無(wú)機(jī)鹽，硫酸軟骨素即可與加入的無(wú)機(jī)鹽中的陽(yáng)離子形成不溶性沉淀析出3、季銨鹽-硫酸軟骨素復(fù)合物充分粉碎后，用無(wú)機(jī)鹽飽和的乙醇震蕩數(shù)小時(shí)，復(fù)合物中季銨鹽離子即與無(wú)機(jī)鹽中的陽(yáng)離子發(fā)生交換，不溶性的硫酸軟骨素可經(jīng)離心或過(guò)濾收集第25頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六、CPC法與其他方法結(jié)合在純化中的應(yīng)用第26頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月目前，CPC法已經(jīng)發(fā)展成一種既適用于微量分析，又可用于大規(guī)模生產(chǎn)的方法CPC-鹽梯度純化法：將糖胺聚糖混合液溶于鹽溶液，加入CPC(CPC預(yù)先溶于等濃度的鹽溶液，濃度為10%)，逐步稀釋混合液，分批收集沉淀；或?qū)⒒旌咸前肪厶撬芤号c3倍CPC混合，隨后逐步升高鹽濃度分批解離使硫酸軟骨素得以純化第27頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CPC法在分離硫酸軟骨素A和硫酸軟骨素C中的應(yīng)用硫酸軟骨素A、C結(jié)構(gòu)相似，單獨(dú)用CPC法進(jìn)行分離是非常困難的，但兩者的CPC復(fù)合物在有機(jī)溶劑中的溶解度存在差異，因此可采用CPC-纖維素柱結(jié)合加以分離，如硫酸軟骨素A可以40%丙醇/20%甲醇/1.5%乙酸洗脫，而硫酸軟骨素C則保留在柱上第28頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CPC法在分離硫酸軟骨素（A、C）和硫酸皮膚素（硫酸軟骨素B）中的應(yīng)用艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸pK值存在差異（分別為3.6和3.1），因此可在合適的條件下加以分離，在適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件下，當(dāng)艾杜糖醛酸的解離受到抑制時(shí)，硫酸皮膚素-CPC復(fù)合物的溶解度大大低于硫酸軟骨素，此時(shí)如在0.1mol/LHAc/0.7mol/LMgCl2溶液中，硫酸皮膚素析出，而硫酸軟骨素保留在溶液中第29頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CPC法在分離不同硫酸化程度的硫酸軟骨素中的應(yīng)用根據(jù)硫酸化程度的不同，硫酸軟骨素可分為三組：非硫酸化的軟骨素、單硫酸化的硫酸軟骨素、多硫酸化的硫酸軟骨素，糖胺聚糖-CPC可溶于某些有機(jī)溶劑，當(dāng)和這些復(fù)合物的丁醇溶液相平衡的水相發(fā)生微小的鹽濃度變化時(shí)，有機(jī)相中的硫酸軟骨素即可向水相轉(zhuǎn)移，據(jù)此，逐步提高水相的鹽濃度，即可分離不同硫酸化程度的硫酸軟骨素第30頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月需要指出的是，由于各種硫酸軟骨素在分子量、硫酸化程度及方式和糖醛酸組成等方面的不均一性，因而企圖把消化液中的硫酸軟骨素混合物分離成單一純組分往往是不合實(shí)際的下圖為Sigma公司硫酸軟骨素C標(biāo)準(zhǔn)品的液相分析第31頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月可見(jiàn)，即便是Sigma公司硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品，也不可能做到結(jié)構(gòu)的絕對(duì)均一第32頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月七、鹽溶液沉淀法第33頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月糖胺聚糖在水溶液中經(jīng)有機(jī)酸、堿或鹽處理即發(fā)生不溶性沉淀，其中部分反應(yīng)已用于糖胺聚調(diào)的分離純化中透明質(zhì)酸和肝素在高濃度乙酸溶液中能直接沉淀析出透明質(zhì)酸在高濃度硫酸銨溶液中可被吡啶沉淀肝素與鹽酸聯(lián)苯胺可發(fā)生專(zhuān)一性沉淀牛肺提取液中經(jīng)硫酸鋇-乙酸沉淀，結(jié)合其他方法能得到硫酸角質(zhì)素純品第34頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月不同糖胺聚糖的鉀鹽在相同條件下溶解度有很大差異，應(yīng)用此原理可以分批沉淀不同糖胺聚糖：如硫酸角質(zhì)素溶解度為3mg/mL，硫酸軟骨素為0.5mg/mL，肝素為0.06mg/mL第35頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月八、離子交換色譜在純化中的應(yīng)用第36頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月離子交換色譜法用于硫酸軟骨素的分離純化先于季銨鹽沉淀法，并因此而導(dǎo)致了某些新的糖胺聚糖的發(fā)現(xiàn)離子交換樹(shù)脂可以反復(fù)應(yīng)用，因此大大節(jié)省了純化成本溫和的分離條件避免了對(duì)糖鏈結(jié)構(gòu)的影響具有從稀溶液（包括組織消化液）中吸附糖胺聚糖的能力，從而適合大體積溶液的濃縮離子交換法可分為陰離子交換和陽(yáng)離子交換第37頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月陰離子交換色譜與陽(yáng)離子交換相比，陰離子交換色譜更常用于不同糖胺聚糖之間的分離由于不同糖胺聚糖的分子結(jié)構(gòu)不同，所攜帶的負(fù)電荷量不同，在陰離子交換樹(shù)脂上的保留行為不同，因此，可采用不同鹽濃度洗脫而得以分離第38頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月國(guó)外常用的DEAE弱陰離子交換第39頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Q-FF強(qiáng)陰離子交換色譜分離不同糖胺聚糖第40頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月對(duì)各種陰離子交換樹(shù)脂的評(píng)價(jià)文獻(xiàn)常用的陰離子交換樹(shù)脂包括Dowex聚苯乙烯樹(shù)脂、DEAE-纖維素等纖維素類(lèi)樹(shù)脂、DEAE-Sephadex、QAE-Sephadex等葡聚糖類(lèi)樹(shù)脂，不同樹(shù)脂各有優(yōu)劣Dowex在分離清晰度方面較纖維素類(lèi)為佳交聯(lián)度：交聯(lián)度高的樹(shù)脂網(wǎng)眼較小，大分子的糖胺聚糖不易進(jìn)入樹(shù)脂內(nèi)部，因此實(shí)際交換量往往較小第41頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月交換容量：纖維素類(lèi)較小，而樹(shù)脂類(lèi)或凝膠類(lèi)較大，前者一般為0.3～1.0mmol/g，后者則在2.5～3.5mmol/g左右交換劑上功能基團(tuán)的解離狀態(tài)也可能影響交換能力：不同交換劑的最佳交換條件各有不同，一般來(lái)說(shuō)，上柱溶液中加入氯化納至0.03～0.05mol/L可以增加吸附交換量溶液pH也可能影響交換量第42頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月陽(yáng)離子交換色譜在硫酸軟骨素純化中的應(yīng)用硫酸軟骨素粗提消化液中，往往會(huì)殘留蛋白質(zhì)及肽等雜質(zhì)。實(shí)驗(yàn)室中常用三氯乙酸沉淀去除雜蛋白，但不適用于生產(chǎn)絕大多數(shù)氨基酸的等電點(diǎn)均在4.0以上，因此，在pH4.0或以下的溶液中，蛋白質(zhì)攜帶正電荷，而硫酸軟骨素分子中含有糖醛酸及硫酸酯基，而攜帶負(fù)電荷，因此，采用陽(yáng)離子交換時(shí)，蛋白質(zhì)被吸附在柱上，而硫酸軟骨素則被洗脫第43頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Dowex強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑在純化硫酸軟骨素中的應(yīng)用第44頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月組織粗提液在分別經(jīng)透析和陽(yáng)離子交換后的蛋白質(zhì)去除效果組織粗提液（左）、透析后（中）及陽(yáng)離子交換色譜純化后（右）的薄層色譜，經(jīng)茚三酮染色后的效果第45頁(yè)，課件共53頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月國(guó)產(chǎn)大孔型強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂在純化硫酸軟骨素中效果