薄層層析分離方法

關(guān)于薄層層析分離方法第1頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月Thin-layerchromatographyandcolumnchromatographyandaredifferenttypesofliquidchromatography.Themobile(moving)phaseisaliquid.Thestationaryphaseisusuallysilicaoralumina.Thisphaseisverypolar.Theprincipleofoperationisthesame!第2頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月ThinLayerChromatographyThesurfaceoftheplateconsistsofaverythinlayerofsilicaonaplasticoraluminumbacking.Thesilicaisverypolar.Thisisthestationaryphase.Spotthematerialattheorigin(bottom)oftheTLCplate.Placetheplateintoaglassjarwithasmallamountofasolventintheglassjar.Thissolventactsasthemovingphase.Removetheplatefromthebottlewhenthesolventisclosetothetopoftheplate.Visualizethespots.Non-polarcompoundswillbelessstronglyattractedtotheplateandwillspendmoretimeinthemovingphase.Thiscompoundwillmovefasterandwillappearclosertothetopoftheplate.Polarcompoundswillbemorestronglyattractedtotheplateandwillspendlesstimeinthemovingphaseandappearlowerontheplate.第3頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月StationaryPhase:Silica(SiO2)第4頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月StationaryPhase:AluminaAcidic:-Al-OHNeutral:-Al-OH+-Al-O-Basic:-Al-O-第5頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

第6頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月Thin-LayerChromatography:ATwo-ComponentMixtureMorepolar!Lesspolar!solvent

frontoriginmixturesolvent

frontcomponent

Bcomponent

Aoriginsolvent

frontcomponent

Bcomponent

AoriginIncreasingDevelopmentTime第7頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月BesuretoremovetheTLCplatewhenitappearsthatthesolventfrontisn’tmoving!Reason:thesolventisevaporatingasitmovesuptheplate.Results:Ifyoudon’tremovetheplateallofthespotswillappearnearthetopoftheplate!!!!!Thisisn’taprettysightandmakesitdifficulttogetgoodRfvalues!Importanthint!第8頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月VisualizationMethodThepreviousslideshowscoloredspots.Mostofthetime,thespotswon’tshowunlesstheyarevisualized!VizualizationisamethodthatisusedtorendertheTLCspotsvisible.Avisualizationmethodcanbe:UltravioletlightIodinevaporstostainspotsColoredreagentstostainspotsReagentsthatselectivelystainspotswhileleavingothersunaffected.第9頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月Thin-LayerChromatography:DeterminationofRfValuesRfofcomponentA=dAdSRfofcomponentB=dBdSTheRfvalueisadecimalfraction,generallyonlyreportedtotwodecimalplaces第10頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月Thin-LayerChromatography:QualitativeAnalysis第11頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月1、薄層色譜：薄層色譜法，是將適宜的固定相涂布于玻璃板上，成一均勻薄層。等點樣、展開后，與適宜的對照物按同法所得的色譜圖作對比，用以進行藥品的鑒別，雜質(zhì)檢查或含量測定的方法。第12頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月2儀器與材料：2.1玻板：除另有規(guī)定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的規(guī)格，要求光滑，平整、洗凈后的不附水珠，晾干。第13頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月2.2固定相或載體：最常用的有硅膠G、硅膠GF、硅膠H、硅膠HF254，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化鋁、氧化鋁G、微晶纖維素、微晶纖維素F254等。其顆粒大小，一般要求直徑為10—40μm。薄層涂布，一般可分無粘合劑和含粘合劑兩種；前者系將固定相直接涂布于玻璃板上，后者系在固定相中加入一定量的粘合劑，一般常用10—15%煅石膏（CaSO4·2H2O在140℃烘4小時），混勻后加水適量使用，或用羧甲基纖維素鈉水溶液（0.5—0.7%）適量調(diào)成糊狀，均勻涂布于玻璃板上。也有含一定展開液或緩沖液的薄層。第14頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月2.3涂布器：應(yīng)能使固定相或載體在玻璃板上涂成一層符合厚度要求的均勻薄層。2.4點樣器：常用具支架的微量注射器或定時毛細管，應(yīng)能使點樣位置正確集中。2.5展開室：應(yīng)使用適合薄層板大小的玻璃制薄層色譜展開缸，并有嚴(yán)密蓋子，除另有規(guī)定外，底部應(yīng)平整光滑，應(yīng)便于觀察。第15頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月各種特制薄層混合薄層酸堿薄層和pH緩沖薄層絡(luò)合薄層

:用AgNO3。等無機試劑的水溶液代替水調(diào)硅膠糊來鋪制絡(luò)合薄層

涂布固定液的薄層

高效薄層:它是由粒度十分均勻，直徑最小為5μm，—般為10μm左右的硅膠吸附劑，加上高度惰性的粘合劑，鋪成質(zhì)地十分致密、平滑的高效高層預(yù)制板。這種預(yù)制板性能極穩(wěn)定，層析展開后所得斑點仍保持圓形不拖尾，分離清晰，分離效果極好。理論塔板高度最小可達12μm，一般在20～30μm。展開3~7cm，理論塔板數(shù)可達數(shù)千，為一般薄層的十倍。

第16頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月3操作方法：3.1薄層板制備：除另有規(guī)定外，將1份固定相和3份水在研缽中向一方向研磨混合，去除表面的泡后，倒入涂布器中，在玻璃板上平穩(wěn)地移動涂布器進行涂布（厚度為0.2—0.3mm），取下涂好薄層的玻璃板，置水平臺上于室溫下晾干，后在110℃烘30分鐘。即置有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度（可通過透射光和反射光檢視）。第18頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月3.2點樣：除另有規(guī)定外，用點樣器點樣于薄層板上，一般為圓點，點樣基線距底邊2.0cm，點樣直徑為2—4mm，點間距離約為1.5—2.0cm，點間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出為宜。點樣時必須注意勿損傷薄層表面。第19頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月3.3展開：展開室如需預(yù)先用展開劑飽和，可在室中加入足夠量的展開劑，并在壁上貼二條與室一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開劑中，密封室頂?shù)纳w，使系統(tǒng)平衡或按正文規(guī)定操作。將點好樣品的薄層板放入展開室的展開劑中，浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.5—1.0cm（切勿將樣點浸入展開劑中），密封室蓋，等展開至規(guī)定距離（一般為10—15cm），取出薄層板，晾干，按各品種項下的規(guī)定檢測，如需用薄層掃描儀對色譜斑點作掃描檢出，或直接在薄層上對色譜斑點作掃描定量，則可用薄層掃描法。第20頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

直線式展開

直線式展開技術(shù)可以分為近水平展開、上行展開、下行展開、雙向展開和水平展開五種形式，薄層色譜分寓一般樣品多采用上行展開方法。

第21頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

1．近水平展開

將適量展開劑傾人長方形玻璃展開槽中，點樣后的薄層板浸入溶劑0.5cm，薄層上端墊高使薄層與水平成5～10o角，展開劑由下而上進行展開，這種方法常用于不含粘合劑的軟板展開．第22頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月2．上行展開流動相沿薄層固定相向上運動的展開方式。此時薄層板放置的角度對流動相移動速率和斑點形狀有一定影響。薄層板水平角度為75o時，對展開最為有利。這種展開方式適合于含有粘合劑的硬板展開。第23頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月3．下行展開

在展開槽內(nèi)薄層板上端放置一個盛展開劑的溶劑槽，用厚濾紙將溶劑引到薄層板的上端，使展開劑自上而下流動。下行法中展開劑受重力和毛細管作用雙重影響，因此展開速度較快。由于這種展開方式采用的裝置比較復(fù)雜，目前只有在葡聚糖凝膠板上展開時或紙色譜中采用．

第24頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月4．二維展開

在正方形薄層板上，在兩個垂直的方向進行基于相同或不同機理的展開．將樣品點在薄層板的一個角上，第一方向展開適當(dāng)距離后，取出薄層板，并使溶劑完全蒸發(fā)，再以與原點成90o方向展開。第二方向展開可采用不同溶劑，也可將薄層板進行化學(xué)反應(yīng)后，再行第二方向展開，通稱雙向展開.

二維展開常用于復(fù)雜較多組分樣品的展開，通過調(diào)節(jié)展開劑極性，增加展開距離，進一步提高分離能力．這種方法多用于定性，很少用于定量。

第25頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月5．水平展開

圓形離心式展開

圓形向心式展開

特殊展開技術(shù)

:多次展開、分步展開、離心展開、梯度洗脫展開、梯度薄層、多維技術(shù)、加壓展開、控溫展開、楔形技術(shù)

第26頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

薄層掃描的方法，除另有規(guī)定外，可根據(jù)各種薄層掃描儀的結(jié)構(gòu)特點及使用說明，結(jié)合具體情況，選擇吸收法或熒光法，用雙波長或單波長掃描。由于影響薄層掃描結(jié)果的因素很多，故應(yīng)在保證供試品的斑點在一定濃度范圍內(nèi)呈線性的情況下，將供試品與對照品在同一塊薄層上展開后掃描，進行比較并計算定量，以減少誤差。各種供試品，只有得到分離度和重現(xiàn)性好的薄層色譜，才能獲得滿意的結(jié)果。第27頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月4注意事項：4.1所用玻璃板應(yīng)洗凈不掛水珠，光滑平整。4.2鋪板要均勻，厚度適宜，并于室溫下晾干后在110℃活化30分鐘，置于有干燥劑的干燥箱或干燥器中備用。4.3點樣點一般為圓點，不能太大。

第28頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月鋪板

鋪板用的勻漿不宜過稠或過稀：過稠，板容易出現(xiàn)拖動或停頓造成的層紋；過稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G:水=1：2～3，硅膠G:羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時間，根據(jù)經(jīng)驗來定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過拿起研棒時勻漿下滴的情況來判斷，越稠越難下滴。勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進一步影響上樣量。涂層薄，點樣易過載；涂層厚，顯色不那么明顯。通常，板的質(zhì)量對薄層鑒別的影響不是很大，影響最大的是展開劑的配制和展開系統(tǒng)的飽和。第29頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月第30頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月第31頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月點樣

盡量用小的點樣管。如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點樣管。這樣，點的斑點較小，展開的色譜圖分離度好，顏色分明。樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，點樣斑點擴散大。樣品溶液的溶劑一般是無水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。點好樣的薄層板用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹干或放入干燥器里晾干。第32頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月展開劑配制

選擇合適的量器把各組成溶劑移入分液漏斗，強烈振搖使混合液充分混勻，放置，如果分層，取用體積大的一層作為展開劑。絕對不應(yīng)該把各組成溶液倒入展開缸，振搖展開缸來配制展開劑?；旌喜痪鶆蚝蜎]有分液的展開劑，會造成層析的完全失敗。各組成溶劑的比例準(zhǔn)確度對不同的分析任務(wù)有不同的要求，盡量達到實驗室儀器的最高精確度，比如：取1ml的溶劑，應(yīng)使用1ml的單標(biāo)移液管，移液管應(yīng)符合計量認證要求，盡管多數(shù)時候這不是必須的。第33頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月第34頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月展開系統(tǒng)的飽和

一般使用的是雙槽的展開缸，一槽用來放展開劑，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展開的板放入兩槽間的平臺，斜架著，蓋上展開缸的蓋子。讓展開劑的蒸氣充滿展開缸，并使薄層板吸附蒸氣達到飽和，防止邊沿效應(yīng)，飽和時間在半個小時左右。展開時難免要打開蓋子把薄層板放入展開劑中，不過對薄層板與蒸氣的吸附平衡影響不大，當(dāng)然動作應(yīng)該盡量輕、快。第35頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月(a)點狀點樣(b)條狀點樣(c)頸部點樣(d)溝槽點樣第36頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月第37頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月1．氨基丙酸；2．β-氨基丙酸;3．γ—氨基丁酸；4．精氨酸；5．絲氨酸；6．天門冬氨酸；7．羥基脯氨酸；8．脯氨酸；9．蛋氨酸；10．酪氨酸；11．谷氨酸；12．蘇氨酸；13．甘氨酸;14．組氨酸;15．羧基賴氨酸；16．亮氨酸；17．異亮氨酸；18．賴氨酸；19．纈氨酸；20．蛋氨酸砜;21．色氨酸;22．苯丙氨酸；23．磺基丙氨酸23種氨基酸的雙向?qū)游鰣D譜第38頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月溫濕度的控制

溫濕度對薄層影響都很大。不凍結(jié)的前提下，通常溫度越低分離越好，較難的分離需在低溫下分離，例如人參皂苷。濕度的影響，估計主要是影響薄層板的吸附能力，導(dǎo)致選擇性（容量因子）的變化，濕度應(yīng)根據(jù)實際情況確定。溫度控制使用空調(diào)器或冰柜，濕度控制是通過在另一展開槽放置相應(yīng)濃度的硫酸。第39頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月顯色方法物理顯色化學(xué)顯色第40頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月物理顯色含有共軛雙鍵的有機物質(zhì)能吸收紫外光，將分離后的薄層板置于紫外燈下，組分薄層呈現(xiàn)暗色斑；如果采用硅腔GF(或其它含有熒光指示劑的吸附劑)鋪成的薄層，在紫外光照射下，整個薄層呈顯黃綠色熒光，斑點部分呈現(xiàn)暗色，更為明顯。第41頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月利用蒸氣熏顯色時，常用的試劑有固體碘、濃氨水、液體溴。進行顯色時，把這些易揮發(fā)的試劑放置在密閉容器內(nèi)（例如標(biāo)本瓶、標(biāo)本缸、干燥器等），使它們的蒸氣充滿整個容器，將已展開并已揮發(fā)去溶劑的薄層板放入其中，使之顯色。第42頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月化學(xué)顯色的方式通常有直接噴霧法和浸漬法兩種。

化學(xué)顯色常用的顯色劑劑大致可以分為兩類，即通用顯色劑和專屬性顯色劑。通用顯色劑：對未知化合物的檢測，可以考慮先用通用顯色劑。這種顯色劑是利用它與被測組分的氧化還原反應(yīng)、脫水反應(yīng)及酸堿反應(yīng)等而顯色的，常用的有50％的硫酸溶液、酸堿指示劑溶液、5％磷鉬酸乙醇溶液、熒光顯色劑等。第43頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月顯色:噴顯色劑顯色最重要是有好的霧化器。第44頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月專屬性顯色劑：對含有特征官能團的組分常采用專屬性顯色劑。薄層板噴以0.4％2,4-二硝基苯肼的鹽酸溶液或鹽酸乙醇溶液后，再噴0.2%的鐵氰化鉀的稀鹽酸溶液，飽和醛、酮類有機物分別顯橄欖綠色和藍色，而不飽和羰基化合物顏色較淺或不變色。芳香族含氮化合物如生物堿等施以碘化鉍鉀試劑后會呈現(xiàn)橘紅色斑點。第45頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月斑點組分定性、定量方法

比移值定性光譜定性各種聯(lián)用檢測儀器定性目視比較半定量法測量斑點面積以進行定量測定從薄層上將被測組分洗脫下來進行定量測定第46頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月第47頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月藥物薄層色譜法介紹薄層色譜法，系將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層。待點樣、展開后，與適宜的對照物按同法所得的色譜圖作對比，用以進行藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測定的方法。

第48頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月1.儀器與材料(1)玻板除另有規(guī)定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的規(guī)格,要求光滑、平整1.儀器與材料，洗凈后不附水珠，晾干。(2)固定相或載體最常用的有硅膠G、硅膠GF<[254]>、硅膠H、硅膠HF<[254]>,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化鋁、氧化鋁G、微晶纖維素、微晶纖維素F<[254]>等。其顆粒大小,一般要求直徑為10～40μm。第49頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

薄層涂布,一般可分無粘合劑和含粘合劑兩種;前者系將固定相直接涂布于玻璃板上,后者系在固定相中加入一定量的粘合劑，一般常用10～15％煅石膏(CaSO4.2H2O在140℃烘4小時)，混勻后加水適量使用，或用羧甲基纖維素鈉水溶液(0.5～0.7％)適量調(diào)成糊狀，均勻涂布于玻璃板上。也有含一定固定相或緩沖液的薄層。

第50頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)涂布器應(yīng)能使固定相或載體在玻璃板上涂成一層符合厚度要求的均勻薄層。(4)點樣器同紙色譜法項下。(5)展開室應(yīng)使用適合薄層板大小的玻璃制薄層色譜展開缸，并有嚴(yán)密的蓋子，除另有規(guī)定外，底部應(yīng)平整光滑，應(yīng)便于觀察。第51頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月2.操作方法

(1)薄層板制備除另有規(guī)定外,將1份固定相和3份水在研缽中向一方向研磨混合,去除表面的氣泡后，倒入涂布器中,在玻板上平穩(wěn)地移動涂布器進行涂布（厚度為0.2～0.3mm），取下涂好薄層的玻板，置水平臺上于室溫下晾干，后在110℃烘30分鐘，即置有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度（可通過透射光和反射光檢視）。第52頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)點樣除另有規(guī)定外，用點樣器點樣于薄層板上，一般為圓點，點樣基線距底邊2.0cm，樣點直徑及點間距離同紙色譜法,點間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出為宜。點樣時必須注意勿損傷薄層表面。第53頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)展開

展開室如需預(yù)先用展開劑飽和，可在室中加入足夠量的展開劑，并在壁上貼二條與室一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開劑中，密封室頂?shù)纳w，使系統(tǒng)平衡或按正文規(guī)定操作。

將點好樣品的薄層板放入展開室的展開劑中,浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.5～1.0cm（切勿將樣點浸入展開劑中）,密封室蓋,待展開至規(guī)定距離(一般為10～15cm),取出薄層板，晾干，按各品種項下的規(guī)定檢測。第54頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月(4)如需用薄層掃描儀對色譜斑點作掃描檢出，或直接在薄層上對色譜斑點作掃描定量，則可用薄層掃描法。薄層掃描的方法，除另有規(guī)定外，可根據(jù)各種薄層掃描儀的結(jié)構(gòu)特點及使用說明，結(jié)合具體情況，選擇吸收法或熒光法，用雙波長或單波長掃描。由于影響薄層掃描結(jié)果的因素很多，故應(yīng)在保證供試品的斑點在一定濃度范圍內(nèi)呈線性的情況下，將供試品與對照品在同一塊薄層上展開后掃描，進行比較并計算定量，以減少誤差。各種供試品，只有得到分離度和重現(xiàn)性好的薄層色譜，才能獲得滿意的結(jié)果。第55頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月薄層