熒光定量核酸檢測(cè)技術(shù)

關(guān)于熒光定量核酸檢測(cè)技術(shù)第1頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月主要表現(xiàn)為PCR產(chǎn)物分析手段落后：

瓊脂糖凝膠電泳法只能判斷產(chǎn)物片段大小，并不能鑒別產(chǎn)物特異性。造成傳統(tǒng)PCR檢測(cè)缺點(diǎn)非特異性難以判斷、假陽性多和重復(fù)性差等。實(shí)驗(yàn)室管理制度落后；人員培訓(xùn)水平落后；國內(nèi)PCR市場存在的問題第2頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月反相膜雜交技術(shù)復(fù)星微孔板雜交技術(shù)復(fù)星、華美、復(fù)華、浩源、錦宏熒光PCR技術(shù)復(fù)星、達(dá)安、匹基國內(nèi)發(fā)展的核酸檢測(cè)新技術(shù)第3頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月反相膜雜交技術(shù)原理首先將特異性探針交聯(lián)在固相載體膜上，這時(shí)載體膜以及膜上的探針相當(dāng)于固定相，當(dāng)膜條的一端與帶有雜交反應(yīng)物的液面接觸時(shí)，帶有生物素標(biāo)記的基因片段、標(biāo)記酶、酶底物依次通過這個(gè)固定點(diǎn)時(shí)，其表現(xiàn)的效應(yīng)行為類似于過濾或者是親和層析，這時(shí)探針有機(jī)會(huì)與流動(dòng)相中的靶序列充分作用特異性結(jié)合（雜交），再經(jīng)過酶顯色最終顯示出藍(lán)紫色斑點(diǎn)。第4頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月反相膜雜交原理示意圖第5頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月主要優(yōu)點(diǎn)：1.操作簡便；2.無特殊設(shè)備要求；

3.適合于分型；4.結(jié)果可原始保存。主要缺點(diǎn)：只能進(jìn)行半定量操作第6頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月微孔板雜交技術(shù)原理具體來講，用生物素（Biotin）標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與固定在酶標(biāo)板上的鏈霉親合素（Streptavidin，SA）結(jié)合，再與抗原標(biāo)記的特異性HBV探針進(jìn)行正向法雜交。產(chǎn)物通過探針連接的抗體酶識(shí)別基團(tuán)和標(biāo)記堿性磷酸酶的抗體特異結(jié)合后，酶催化底物，在酶標(biāo)板中顯出顏色，通過酶標(biāo)儀讀取光吸收值。第7頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月微孔板雜交技術(shù)原理示意圖第8頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月主要優(yōu)點(diǎn)：

1.雜交部分操作類似于ELISA，實(shí)驗(yàn)人員較熟悉；

2.可向全自動(dòng)過度；

3.可定量操作。主要缺點(diǎn)：

1.分型困難；

2.試劑成本較高；

3.操作較復(fù)雜。第9頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光PCR技術(shù)原理熒光PCR試劑比常規(guī)PCR試劑多一個(gè)寡聚核苷酸探針，這個(gè)探針帶有一個(gè)熒光發(fā)光分子和一個(gè)熒光淬滅分子，完整的探針在激發(fā)光激發(fā)下，發(fā)光分子所產(chǎn)生的熒光被淬滅分子全部吸收，樣品無熒光。而PCR過程中。Taq酶分子在鏈延長過程中可以通過自身的5’3’核酸外切酶降解與模板結(jié)合的特異性熒光探針，使得熒光發(fā)光分子從探針上切下來而與熒光淬滅分子分開，從而在激發(fā)光激發(fā)下產(chǎn)生特定波長的熒光，這種熒光隨著PCR擴(kuò)增過程而動(dòng)態(tài)增強(qiáng)。第10頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光PCR技術(shù)原理示意圖第11頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月主要優(yōu)點(diǎn)：

1.能對(duì)靶基因進(jìn)行定量檢測(cè)；

2.在封閉狀態(tài)下進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)，減少了污染機(jī)會(huì)。主要缺點(diǎn)：

1.儀器設(shè)備昂貴，不利于推廣；

2.分型困難。第12頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置為了防止由標(biāo)本（微生物或非微生物）和靶核酸模板以及經(jīng)PCR擴(kuò)增的靶核酸片段所引起的交叉污染，核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)設(shè)置三個(gè)專用的實(shí)驗(yàn)室。前PCR區(qū)1（試劑配制實(shí)驗(yàn)室）

用途：該實(shí)驗(yàn)室是無臨床標(biāo)本和無核酸污染區(qū)，用于配制各類試劑及設(shè)置PCR擴(kuò)增反應(yīng)管無（靶核酸模板）。

基本設(shè)備：1.實(shí)驗(yàn)應(yīng)有紫外燈；2.PCR防污染罩；

3.冰箱（4℃，-20℃）；4.臺(tái)式小型高速離心機(jī)、旋渦振蕩器、各種規(guī)格移液器（0-10ul、40-200ul、50-1000ul）等；5.高壓滅菌的各種Eppendorf管和移液器吸嘴；6.專用文具用品；7.實(shí)驗(yàn)桌椅（實(shí)驗(yàn)臺(tái)臺(tái)面防酸、防堿和耐熱）；8.自來水設(shè)備第13頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月前PCR區(qū)2（標(biāo)本制備實(shí)驗(yàn)室）用途：該實(shí)驗(yàn)室用于分離和抽提病原微生物中的核酸，防止因標(biāo)本處理而引起的實(shí)驗(yàn)室感染和檢測(cè)的交叉污染?；驹O(shè)備：1.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有紫外燈；2.超凈臺(tái)或PCR防污染罩；3.冰箱（4℃，-20℃）；4.高壓滅菌器(處理傳染性標(biāo)本和物品)；5.高速和低速離心機(jī)、旋渦振蕩器、各種規(guī)格移液器（0-10ul、40-200ul、50-1000ul）等；6.高壓滅菌的各種Eppendorf管和移液器吸嘴；7.專用文具用品；8.救護(hù)藥箱，包括外傷用藥，眼睛沖洗液等；9.實(shí)驗(yàn)桌椅（實(shí)驗(yàn)臺(tái)臺(tái)面防酸、防堿和耐熱）；10.電話機(jī)（備有關(guān)臨床醫(yī)生的電話號(hào)碼，以便因突發(fā)事件及時(shí)聯(lián)系）；11.自來水設(shè)備。第14頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月后PCR區(qū)（擴(kuò)增和分析實(shí)驗(yàn)室）用途:該實(shí)驗(yàn)室用進(jìn)行PCR擴(kuò)增和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的各類分析操作。

基本設(shè)備：1.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)有紫外燈；2.各類PCR擴(kuò)增儀；3.電泳儀、電泳槽、紫外分析儀；4.照相設(shè)備或凝膠分析系統(tǒng)；5.臺(tái)式小型高速離心機(jī)、孵育箱（水浴或恒溫）；6.冰箱（4℃、-20℃）；7.微波爐；8. 配套移液器（若干）；9.高壓滅菌的各種Eppendorf管和移液器吸嘴。10. 電腦和專用文具用品、救護(hù)藥箱；11.實(shí)驗(yàn)桌椅（實(shí)驗(yàn)臺(tái)臺(tái)面防酸、防堿和耐熱）；12. 自來水設(shè)備;13.其他儀器：根據(jù)檢測(cè)方法不同而定。第15頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月定量技術(shù)比較第16頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月試劑盒的檢測(cè)靈敏度第18頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)HBV-DNA結(jié)果

與臨床的關(guān)系第19頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月經(jīng)統(tǒng)計(jì)，X2=1.15，P<0.05，表明在HBsAg/HBeAg/抗HBc陽性和HBsAg/抗HBe/抗HBc陽性組中病毒載量的差異顯著，HBVDNA和HBeAg密切相關(guān)。該定量結(jié)果能夠反映在這兩種血清學(xué)模式中病毒DNA的復(fù)制情況，對(duì)于臨床輔助診斷有重要作用。表.在HBsAg/HBeAg/抗HBc陽性和HBsAg/抗HBe/抗HBc陽性組中病毒載量頻數(shù)分布

第20頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月慢性肝炎患者干擾能治療過程中病毒核酸

的動(dòng)態(tài)變化

上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院傳染科（200025）

羅振輝厲惠莉高健張東華摘要：本文采用探針雜交定量檢測(cè)HBV-DNA，動(dòng)態(tài)檢測(cè)了15例慢性乙肝患者干擾能治療前、后和治療過程中的HBV-DNA的變化，除見干擾能抑制病毒復(fù)制的作用外，且HBV-DNA的變化較eAg陰轉(zhuǎn)和ALT下降更敏感、更確切的反映了干擾能的療效。干擾能療效的個(gè)體差異甚大，似和機(jī)體感染的嚴(yán)重程度及自身的清除能力有關(guān)，HBV-DNA的動(dòng)態(tài)檢測(cè)，結(jié)合eAg和ALT的變化，可有助于決定適當(dāng)?shù)膭┝亢秃侠淼寞煶獭５?1頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月

部分討論：15例病人中eAg均為陽性，但HBV-DNA值的差異甚大，從1.768Meq/ml到4800Meq/ml，該值更確切的反映了機(jī)體的感染狀態(tài)，其高低可能與感染的嚴(yán)重程度及病毒復(fù)制的活躍情況呈正相關(guān)；與機(jī)體免疫清除的時(shí)間和強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)。高值示感染嚴(yán)重或清除無力；反之表示感染較輕或清除強(qiáng)力。實(shí)驗(yàn)表明HBV-DNA低值者療效較佳；無論HBV-DNA值是高是低，治療后HBV-DNA均見一定程度下降，其下降的幅度與病例的選擇；eAg的陰轉(zhuǎn)率6個(gè)月時(shí)為8/15，和國內(nèi)外諸多報(bào)告大致相似，此變化和HBV-DNA值的低下基本吻合，但HBV-DNA值在6個(gè)月時(shí)已有9例小于0.7Meq/ml，且見HBV-DNA的變化大多早于eAg的陰轉(zhuǎn)，一般提早2個(gè)月，個(gè)別提前4個(gè)月，可見HBV-DNA值的檢測(cè)遠(yuǎn)較觀察eAg更敏感、更確切的反映了干擾能抗病毒的作用。第22頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月ALT的變化通常也是評(píng)估干擾能治療的重要指標(biāo)，本組病例6個(gè)月時(shí)ALT下降至正常者為11/15（73.3%），無明顯變化或升高者為4/15，此變化和HBeAg的陰轉(zhuǎn)大致吻合，但和HBV-DNA低下并非完全一致。2號(hào)病例持續(xù)用藥至8個(gè)月時(shí)ALT明顯升高，繼續(xù)減量用藥后，HBV-DNA低下，有力的說明了ALT升高是機(jī)體清除病毒的正常表現(xiàn)，故以ALT復(fù)常為評(píng)估指標(biāo)應(yīng)有辨證的觀點(diǎn)。結(jié)論：HBV-DNA值的變化充分反映了干擾能抑制病毒復(fù)制的作用明顯，且HBV-DNA的變化較eAg陰轉(zhuǎn)和ALT下降更敏感、更確切的反映了干擾能的療效。對(duì)于每一病例應(yīng)具體分析，力爭以HBV-DNA值作為觀察療效的指標(biāo)，決定適當(dāng)?shù)膭┝?，反?fù)或更長的療程，也許是未來抗病毒治療的方向。第23頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月對(duì)HBV抗病毒治療的定量檢測(cè)建議針對(duì)拉米夫定治療乙型肝炎的定量檢測(cè)建議針對(duì)干擾素治療乙型肝炎的定量檢測(cè)建議可以研究聯(lián)合用藥，并用定量檢測(cè)來評(píng)估療效第24頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月針對(duì)拉米夫定治療乙型肝炎的定量檢測(cè)建議

根據(jù)《拉米夫定臨床應(yīng)用指導(dǎo)意見》（由“拉米夫定臨床應(yīng)用專家指導(dǎo)小組”制定），我們提出了以下對(duì)乙型肝炎病人的定量檢測(cè)建議：病人的選擇：HBVDNA定量檢測(cè)；觀察項(xiàng)目及隨訪：血清病毒學(xué)標(biāo)志：HBeAg，抗HBe，HBVDNA，治療目標(biāo)和療效判斷：病毒學(xué)標(biāo)志改善：HBV-DNA陰轉(zhuǎn)（斑點(diǎn)雜交或定量法降低>2log10）;停藥標(biāo)準(zhǔn)：達(dá)顯效病人，繼續(xù)用藥3-6個(gè)月，仍為顯效者，可停藥；停藥后，繼續(xù)隨訪觀察6-12個(gè)月，每3-6個(gè)月復(fù)查HBVDNA。第25頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月丙型肝炎病毒的核酸檢測(cè)丙肝：輸血后肝炎主要原因急性期2－26周（平均7.4周） 潛伏期1－2個(gè)月酶免檢出率：1月17.4％

2－6月60－80％

1年80％病毒特點(diǎn)：滴度低；免疫反應(yīng)弱；變異快第26頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月HCV病毒載量監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)在常規(guī)病人護(hù)理中扮演的角色開始治療改變治療方案選擇治療方案確證療效第27頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月通過監(jiān)測(cè)HCV病毒滴度反映療效WeeksMedianHCVRNA(copies/ml)第28頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月IFN-單次給藥后HCV-1病毒滴度變

化的定量監(jiān)測(cè)N=32genomes/ml*1million第29頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月淋病雙球菌（NG）的核酸檢測(cè)標(biāo)本取材：男性：作尿道擠壓和前列腺按摩以取得尿道口分泌物女性：宮頸口分泌物診斷方法：

1、涂片染色：在中性粒細(xì)胞中尋找革蘭氏陰性的雙球菌簡便易行，但靈敏度不高，女性病人檢出率僅50%左右

2、分離培養(yǎng)：WHO推薦

培養(yǎng)較困難，生化鑒定復(fù)雜，時(shí)間長

3、ELISA檢測(cè)抗原存在交叉反應(yīng)第30頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月由于PCR具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于淋病的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。利用PCR可以幫助解決的主要問題有：（1）對(duì)分離培養(yǎng)的菌株進(jìn)行鑒定和進(jìn)一步分析。（2）提高檢測(cè)臨床標(biāo)本的陽性率和準(zhǔn)確性。（3）用于抗生素治療的療效觀察。（4）對(duì)淋球菌菌株進(jìn)行分子流行病學(xué)分析。第31頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月沙眼衣原體（CT）的核酸檢測(cè)標(biāo)本取材：同淋球菌在非淋性尿道炎中，由衣原體引起的占50%以上，健康人群約有10%感染率。診斷方法：（1）細(xì)胞培養(yǎng)繁瑣、費(fèi)時(shí)，且培養(yǎng)條件不適、標(biāo)本運(yùn)送不當(dāng)、標(biāo)本不足等因素均可影響檢測(cè)敏感度。（2）免疫熒光法、酶聯(lián)免疫法簡便快速，但靈敏度和特異性均低于培養(yǎng)法。第32頁，課件共36頁，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)用PCR檢測(cè)方法靈敏度、特異性可達(dá)94~100%