第十六章-細胞的破碎

生

化

分

離

過

程

的

一

般

流

程發(fā)酵液細胞分離(離心，過濾)細胞－胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線二細胞破碎碎片分離路線一A路線一B清液－胞外產(chǎn)物粗分離(鹽析、萃取、超過濾等)純化(層析、電泳)脫鹽(凝膠過濾、超過濾)濃縮(超過濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復性√√目前一頁\總數(shù)五十三頁\編于八點3.1概述

胞外型：一些微生物在代謝過程中將產(chǎn)物分泌到細胞之外的液相中（稱胞外酶），這些產(chǎn)品主要為醫(yī)藥、保健產(chǎn)品和工業(yè)用。這些蛋白質(zhì)在細胞培養(yǎng)時被宿主細胞分泌到培養(yǎng)液中，提取過程只需直接采用過濾和離心進行固－液分離，然后將獲得的澄清濾液再進一步純化即可。其后續(xù)分離和純化都相對簡單。目前二頁\總數(shù)五十三頁\編于八點

由于一些重組DNA（rDNA）產(chǎn)品結(jié)構(gòu)復雜，必須在細胞內(nèi)組裝來獲得生物活性，如果在培養(yǎng)時被宿主細胞分泌到培養(yǎng)液中，其生物活性往往有所改變，此類rDNA產(chǎn)品是細胞內(nèi)產(chǎn)品（非分泌型），需要應用細胞破碎技術(shù)破碎細胞，使細胞內(nèi)產(chǎn)物釋放到液相中，然后再進行提純，為后續(xù)的分離純化做好準備工作。概

述胞內(nèi)型：目前三頁\總數(shù)五十三頁\編于八點幾種由大腸桿菌表達的胞內(nèi)重組藥物藥物名稱宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長激素（HGH）大腸桿菌治療侏儒病α--干擾素大腸桿菌治療毛狀細胞白血病和卡波濟肉瘤目前四頁\總數(shù)五十三頁\編于八點

細胞破碎（cellrupture）技術(shù)是指利用外力（物理、化學、酶或機械的方法）破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)。細胞破碎技術(shù)是分離純化細胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎。概

述目前五頁\總數(shù)五十三頁\編于八點

微生物細胞和植物細胞外層均為細胞壁，細胞壁里面是細胞膜，細胞膜和它所包圍的細胞漿合稱原生質(zhì)體。動物細胞沒有細胞壁，僅有細胞膜。通常細胞壁較堅韌，細胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細胞破碎的阻力主要來自于細胞壁。

基于遺傳和環(huán)境等因素，不同類型生化物質(zhì)其細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不完全相同，故細胞壁的機械強度不同，細胞破碎的難易程度也就不同。此外，不同的生化物質(zhì)其穩(wěn)定性有較大差別，在破碎過程中應防止變性和被胞內(nèi)的酶水解，因此，破碎方法的選擇和操作條件的優(yōu)化是十分必要的。目前六頁\總數(shù)五十三頁\編于八點革蘭陽性細菌細胞壁結(jié)構(gòu)模式圖革蘭陰性細菌細胞壁結(jié)構(gòu)模式圖

3.2細菌細胞壁結(jié)構(gòu)和化學組成目前七頁\總數(shù)五十三頁\編于八點細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)（細菌肽聚糖結(jié)構(gòu)示意圖）

幾乎所有細菌的細胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）組成，它是難溶性的聚糖鏈（glycanchain），借助短肽交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細胞周圍，使細胞具有一定的形狀和強度。

破碎細菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度，如果交聯(lián)程度大，則網(wǎng)結(jié)構(gòu)就致密。

目前八頁\總數(shù)五十三頁\編于八點

☆陰性菌的肽聚糖層較薄，僅2～3nm，占細胞壁成分的10％左右,由于肽聚糖之間僅由四肽側(cè)鏈直接連接，缺乏五肽橋，故層較疏松，而且肽聚糖居于細胞壁最內(nèi)層，緊貼在細胞膜上，在肽聚糖層外面還有一較厚的外壁層(約8～10nm)，主要成分為脂蛋白、脂多糖和其它脂類，因此，革蘭氏陰性菌細胞壁中脂類含量較高。☆革蘭氏陽性菌細胞壁較厚，具有20～80nm的肽聚糖層，約占細胞壁成分的40～90％，此外細胞壁還含有大量磷壁酸。目前九頁\總數(shù)五十三頁\編于八點酵母菌酵母菌一般有很高的營養(yǎng)價值，特別是含有50%蛋白質(zhì)，很多B族維生素、核酸和礦物質(zhì)，同時也能產(chǎn)生一些保健功能活性物質(zhì)。畜禽飼料(單細胞蛋白，SCP)食品添加劑（啤酒酵母）目前十頁\總數(shù)五十三頁\編于八點

細胞壁的最里層是由葡聚糖的細纖維組成，它構(gòu)成了細胞壁的剛性骨架，使細胞具有一定的形狀，覆蓋在細纖維上面的是一層糖蛋白，最外層是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯鍵共價連接，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。與細菌細胞壁一樣，破碎酵母細胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。目前十一頁\總數(shù)五十三頁\編于八點某些植物細胞，當生長停止后，在細胞質(zhì)和初生細胞壁之間形成了次生細胞壁。次生壁一般較厚(4μm以上)，常有三層組成。在次生壁中，纖維素和半纖維素含量比初生壁增加很多，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則，而且存在木質(zhì)素（酚類組分的聚合物）的沉積。因此次生壁的形成提高了細胞壁的堅硬性，使植物細胞具有很高的機械強度。目前十二頁\總數(shù)五十三頁\編于八點植物細胞細胞壁的化學組成組分結(jié)構(gòu)和分類纖維素β－1，4－D－葡聚糖半纖維素木葡聚糖甘露聚糖木聚糖果膠物質(zhì)半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白各種酶類凝集素目前十三頁\總數(shù)五十三頁\編于八點組織搗碎勻漿機目前十四頁\總數(shù)五十三頁\編于八點3.3細胞壁的破碎3.3.1破碎率的評價式中：N0（原始細胞數(shù)）

N（經(jīng)t時間操作后保留下來的未損害的細胞數(shù)）目前十五頁\總數(shù)五十三頁\編于八點(1)直接計數(shù)法直接對適當稀釋后的樣品進行計數(shù)，可以通過平板計數(shù)技術(shù)或在血球細胞器上用顯微鏡觀察來實現(xiàn)最終染色細胞的計數(shù)。(2)間接計數(shù)法

間接計數(shù)法是在細胞破碎后，測定懸浮液中細胞釋放出來的化合物的量(例如可溶性蛋白、酶等)。目前十六頁\總數(shù)五十三頁\編于八點3.3.2細胞破碎的方法目前已發(fā)展了多種細胞破碎方法，以便適應不同用途和不同類型的細胞壁破碎。破碎方法可規(guī)納為機械法和非機械法兩大類。目前十七頁\總數(shù)五十三頁\編于八點目前十八頁\總數(shù)五十三頁\編于八點(一)機械法①高速攪拌珠研磨破碎法（Finegrinding）②高壓勻漿破碎法（Homogenization）③超聲波破碎法（Ultrasonication）目前十九頁\總數(shù)五十三頁\編于八點研磨是常用的一種方法，它將細胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細胞獲得破碎。在工業(yè)規(guī)模的破碎中，采用高速珠磨機（瑞士WAB公司和德國西門子機械公司制造）。①高速攪拌珠研磨破碎法（Finegrinding）目前二十頁\總數(shù)五十三頁\編于八點NetzschLM-20型珠磨機目前二十一頁\總數(shù)五十三頁\編于八點高速珠磨機工作原理水平位置的磨室內(nèi)放置玻離小珠，裝在同心軸上的圓盤攪拌器高速旋轉(zhuǎn)，使細胞懸浮液和玻離小珠相互攪動，細胞的破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料的滾動而引起。在料液出口處，旋轉(zhuǎn)圓盤和出口平板之間的狹縫很小，可阻擋玻離小珠，使不被料液帶出。由于操作過程中會產(chǎn)生熱量，易造成某些生化物質(zhì)破壞，故磨室還裝有冷卻夾套，以冷卻細胞懸浮液和玻離小珠。目前二十二頁\總數(shù)五十三頁\編于八點在珠磨法中，細胞的破碎率也能用一級速率方程式表示：ln[1/(1-R)]=KtK－破碎速率常數(shù)t－停留時間R－破碎率破碎速率常數(shù)K與許多操作參數(shù)有關(guān)，如攪拌轉(zhuǎn)速、料液的循環(huán)流速、細胞懸浮液的濃度、玻璃小珠的裝置和珠體的直徑以及溫度等。目前二十三頁\總數(shù)五十三頁\編于八點

1.進入珠磨機的細胞濃度和負荷，料液的流速，攪拌器的轉(zhuǎn)速和構(gòu)型，以及溫度等。這些參數(shù)不僅影響破碎程度，也影響所需能量。

2.珠體的大小應根據(jù)細胞大小和濃度以及在連續(xù)流動的操作過程中不使珠體帶出來選擇。

3.珠體在磨室中的裝量影響破碎程度和所需能量，破碎面包酵母菌適宜的珠體裝量為80％，珠體量的增加使熱擴散性能降低而引起溫度升高。

4.增加攪拌速度能提高破碎效率，但過高的速度反而會使破碎率降低，能量消耗增大，所以攪拌轉(zhuǎn)速應適當。目前二十四頁\總數(shù)五十三頁\編于八點②高壓勻漿破碎法目前二十五頁\總數(shù)五十三頁\編于八點操作原理:

原理：利用高壓使細胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)使細胞破碎，細胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每秒速度高達幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列高速運動過程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細胞破碎。目前二十六頁\總數(shù)五十三頁\編于八點

在工業(yè)規(guī)模的細胞破碎中，對于酵母菌等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。其破碎屬于一級反應速度過程，被破碎的細胞分率符合公式：

ln[1/(l－R)]＝KNPα其中R：破碎率；

K：與溫度有關(guān)的速度常數(shù)；

P：操作壓力；

N：懸浮液通過勻漿器閥的次數(shù)。

a：與微生物種類有關(guān)的常數(shù)；目前二十七頁\總數(shù)五十三頁\編于八點高壓勻漿法適用的范圍酵母和大多數(shù)細菌細胞的破碎。料液細胞濃度可達到20%左右?！顖F狀和系狀菌易造成高壓勻漿器的堵塞，不宜使用高壓勻漿法。目前二十八頁\總數(shù)五十三頁\編于八點高壓勻漿法使用時注意事項高壓勻漿器的操作溫度上升約２-３℃/10MPa為了保護目標產(chǎn)物的生物活性，需要對料液作冷卻處理。多組破碎操作中需要在級間設置冷卻裝置可有效防止溫度上升，保護產(chǎn)物活性。目前二十九頁\總數(shù)五十三頁\編于八點高壓勻漿器破碎細胞

升高壓力有利于破碎，它表明可以減少細胞的循環(huán)次數(shù)，在不明顯增加通過量的情況下，甚至一次通過勻漿閥就可達到幾乎完全的破碎，這樣就可避免細胞碎片不至過小，從而給隨后細胞碎片的分離工作帶來好處。Brokman等人已研究了能適應于高壓操作的勻漿閥，試驗表明在約175MPa的壓力下，破碎率可達100％，但是也有試驗表明當壓力超過一定的值后，破碎率增長得很慢，在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為55~70Mpa。目前三十頁\總數(shù)五十三頁\編于八點③超聲波破碎法目前三十一頁\總數(shù)五十三頁\編于八點超聲波破碎超聲波破碎法（Ultrasonication)利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-20kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液,是一種液相剪切破碎法。

超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型，它是由發(fā)生器和換能器組成，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機械振動。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。目前三十二頁\總數(shù)五十三頁\編于八點目前三十三頁\總數(shù)五十三頁\編于八點超聲波破碎的機理在相當高的輸入聲能下，液體各個成核部位會形成許多小氣泡。在聲波膨脹相中，這些氣泡會增大，而在壓縮相中氣泡會被壓縮，直至不能再壓縮時，氣泡破裂，釋放出猛烈的震波。震波通過介質(zhì)傳播。在氣泡發(fā)生空穴現(xiàn)象的破碎期間，大量聲能被轉(zhuǎn)化成彈性波形式的機械能，引起局部的剪切梯度使細胞破碎。在液流中當某點壓力低于液體所在溫度下的空氣分離壓時，原來溶于液體中的氣體會分離出來產(chǎn)生氣泡，這就叫空穴現(xiàn)象

。目前三十四頁\總數(shù)五十三頁\編于八點超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎是很強烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。超聲波破碎的有效能量利用率極低，操作過程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或外部冷卻的容器中進行。由于對冷卻的要求相當苛刻，所以不易放大，主要用于實驗室規(guī)模的細胞破碎。目前三十五頁\總數(shù)五十三頁\編于八點影響因素：7）細胞懸浮液的流速：取決于停留時間影響總收率。1）振幅：直接與聲能有關(guān)系。2）細胞懸浮液的黏度：影響能耗并會抑制空穴。3）表面張力：影響細胞破碎效率。4）被處理懸浮液的體積：體積大需要能量大。5）珠粒的體積和直徑：添加細小的珠粒（研磨）。6）探頭的形狀和材料：振幅與面積成反比。目前三十六頁\總數(shù)五十三頁\編于八點

超聲波清洗器(DL-720D)DL型系列超聲波清洗器除其本身具有高效，高質(zhì)量的清洗功能外，還具有“脫氣”、“提取”、“乳化”、“加速溶解”、“粉碎”、“分散”等多種功能。產(chǎn)品廣泛應用于各種需要清洗的物品。

SonicsVC750/VC500超聲波破碎儀適用于多種研究領域之多用途多功能的超聲破碎儀，它可處理由幾微升到多達幾百升的有機和無機樣品，能夠破碎各類細胞、細菌、孢子、組織，又可以打碎聚合物，乳化樣品，溶解難溶物質(zhì)，加速反應，霧化液體，分散顆粒，制備樣品，氣化液體及清洗技術(shù)。目前三十七頁\總數(shù)五十三頁\編于八點機械法的缺點：需要高的能量并且產(chǎn)生高溫和高的剪切力，容易使不穩(wěn)定產(chǎn)品變性失活。產(chǎn)物非專一，產(chǎn)生微粒尺寸范圍大，分離困難。目前三十八頁\總數(shù)五十三頁\編于八點二、非機械法①酶溶破碎法（enzymelysis）②化學破碎法（chemicaltreatment）③滲透壓沖擊破碎法（osmoticshock）④凍融破碎法（freezingandthawing）⑤干燥破碎法（drying

）其中酶法和化學法應用最廣。物理法目前三十九頁\總數(shù)五十三頁\編于八點

①酶解酶解是利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。溶菌酶（lysozyme)適用于革蘭氏陰性菌細胞的分解，應用于革蘭氏陰性菌時，需輔以EDTA使之更有效地作用于細胞壁。真核細胞的細胞壁不同于原核細胞，需采用不同的酶。目前四十頁\總數(shù)五十三頁\編于八點目前四十一頁\總數(shù)五十三頁\編于八點酶解法的優(yōu)點

能選擇性地釋放產(chǎn)物抽提的速率和收效高發(fā)生酶解的條件溫和不殘留細胞碎片但酶水解價格高，故小規(guī)模應用較廣。

目前四十二頁\總數(shù)五十三頁\編于八點自溶作用

自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代謝過程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細胞壁上聚合物的酶，以便生長過程繼續(xù)下去。改變其生長環(huán)境，可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達到自溶目的。

目前四十三頁\總數(shù)五十三頁\編于八點②化學法

采用化學法處理可以溶解細胞或抽提胞內(nèi)組分。常用酸、堿、表面活性劑和有機溶劑等化學試劑，可以改變細胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇地滲透出來。目前四十四頁\總數(shù)五十三頁\編于八點酸堿處理，調(diào)節(jié)pH，改變蛋白質(zhì)所帶電荷，物質(zhì)間作用力降低，蛋白質(zhì)溶解。合成的表面活性劑：SDS、TritonX-100和吐溫（Tween-80）等。（兩性化合物，在水中形成膠團，將蛋白質(zhì)包在膠團內(nèi)，而蛋白質(zhì)的親水基向水相，改變其通透性）有機溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等。

（溶劑被細胞壁脂質(zhì)層吸收后，會導致細胞壁膨脹，最后造成細胞壁的破裂）目前四十五頁\總數(shù)五十三頁\編于八點如TritonX-100是一種非離子型清潔劑，對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。目前四十六頁\總數(shù)五十三頁\編于八點化學法和酶法一樣也存在對產(chǎn)物的釋出選擇性好，細胞外形較完整，碎片少，核酸等胞內(nèi)雜質(zhì)釋放少，便于后步分離等優(yōu)點，故使用較多。但該法容易引起活性物質(zhì)失活破壞，因此，根據(jù)生化物質(zhì)的穩(wěn)定性來選擇合適的化學試劑和操作條件是非常重要的。另外，化學試劑的加入，常會給隨后產(chǎn)物的純化帶來困難，并影響最終產(chǎn)物純度。如表面活性劑存在常會影響鹽析中蛋白質(zhì)的沉淀和疏水層析，因此必須注意除去。目前四十七頁\總數(shù)五十三頁\編于八點③滲透壓沖擊法

滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細胞內(nèi)水分便