江南大學(xué)開(kāi)題報(bào)告

直博工作匯報(bào)

匯報(bào)人：李蓓個(gè)人簡(jiǎn)介：2003年7月畢業(yè)于河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)，同年9月開(kāi)始攻讀山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)專(zhuān)業(yè)碩士，師從張舉仁教授，研究方向?yàn)橹参锛?xì)胞工程與基因工程。目前已修完碩士研究生培養(yǎng)方案規(guī)定的課程，成績(jī)優(yōu)秀。

此外，選修了基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)題、分子細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)展、細(xì)胞分化等博士生課程；閱讀了《植物分子遺傳學(xué)》、《從基因到基因組》等專(zhuān)業(yè)書(shū)目，在理論水平上有一定提高；除課程學(xué)習(xí)、實(shí)驗(yàn)室研究工作正常進(jìn)行之外，還大量閱讀與專(zhuān)業(yè)有關(guān)的各類(lèi)文獻(xiàn)資料，思路方面有了一定的擴(kuò)展。

已經(jīng)熟練掌握了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤(pán)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)；掌握了質(zhì)粒重組、DNA和RNA的提取、PCR及SDS等分子生物學(xué)技術(shù)。從黑豆及荷豆2#中克隆了hsp熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子，并進(jìn)行了功能驗(yàn)證。參與重組酶FLP的克隆和重組酶作用位點(diǎn)frt的構(gòu)建，并將它們構(gòu)建入植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行了功能驗(yàn)證。下一階段的工作計(jì)劃和目標(biāo)利用FLP/frt系統(tǒng)去除轉(zhuǎn)基因玉米的選擇標(biāo)記及耐鹽相關(guān)基因的聚合實(shí)驗(yàn)?zāi)康模豪肍LP/frt定點(diǎn)重組系統(tǒng)，獲得去除選擇標(biāo)記基因的玉米轉(zhuǎn)基因植株；

利用二次轉(zhuǎn)化或者有性雜交的方法獲得去除選擇標(biāo)記基因的基因聚合植株；探索高效獲得無(wú)選擇標(biāo)記基因植株的途徑與方法。實(shí)驗(yàn)背景：選擇標(biāo)記基因被廣泛的用于植物轉(zhuǎn)基因中轉(zhuǎn)化子的篩選工作，目前最常用到的選擇標(biāo)記基因大多數(shù)為抗性標(biāo)記基因(resistantmarkergene)。隨著轉(zhuǎn)基因植物的商品化種植，抗性標(biāo)記基因在生態(tài)環(huán)境和食用方面潛在的安全性隱患就成為頗有爭(zhēng)議且懸而未決的問(wèn)題，因此培育無(wú)抗性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物已成為基因工程育種的重要目標(biāo)。完全避免使用抗性標(biāo)記基因使用安全性標(biāo)記基因獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株后將抗性選擇標(biāo)記基因除去共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(Co-transformationsystem)以轉(zhuǎn)座元件為基礎(chǔ)的系統(tǒng)(Transposableelement-basedsystem)同源重組系統(tǒng)(Homologousrecombination)染色體內(nèi)部的重組系統(tǒng)(Intrachromosomalrecombinationsystem)位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)(Site-specificrecombinationsystem)

在植物基因工程中常用的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)主要有以下幾種：來(lái)自于噬菌體P1的Cre/lox系統(tǒng)來(lái)自于釀酒酵母的2μm質(zhì)粒中的FLP/frt系統(tǒng)來(lái)自于接合糖酵母Zymosaccharomycesrouxxi的pSR1質(zhì)粒的R-RS系統(tǒng)來(lái)自于Mu噬菌體的Gin重組酶系統(tǒng)

FLP-frt定點(diǎn)重組系統(tǒng)來(lái)自于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的2μm質(zhì)粒。

該系統(tǒng)包括：FLP重組酶(FLPrecombinase)frt(FLPrecombinationtarget)重組酶作用位點(diǎn)

FLP酶催化frt位點(diǎn)間的特異性重組：根據(jù)frt位點(diǎn)

位置和方向的不同，催化DNA片段的倒位、切除和整合。

1993年，Lyznik等利用FLP酶的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，以玉米和水稻的原生質(zhì)體為材料首次證明了FLP/frt系統(tǒng)在植物中的定點(diǎn)重組功能。1994年，Lloyed和Davies通過(guò)對(duì)煙草穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的研究驗(yàn)證了FLP/frt系統(tǒng)的功能。1996年，Lyznik等通過(guò)對(duì)玉米愈傷組織的研究也證明了該系統(tǒng)的功能。2000年，HongLuo等利用FLP/frt重組系統(tǒng)從雄性不育的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中獲得了育性恢復(fù)的植株，表明該系統(tǒng)可為雜交種或雜交植物的獲得提供一條可供選擇的途徑。工作基礎(chǔ)：已構(gòu)建植物表達(dá)載體：pCAMBIA1300-35S-flp-hptpCAMBIA1300-35S-antiport-frt1-als-frt2pCAMBIA1300-35S-CDH-frt1-als-frt2

pCAMBIA1300-35S-hsp1-flp-hptpCAMBIA1300-35S-hsp2-flp-hpt已構(gòu)建原核表達(dá)載體：pET-42-b(+)-FLP圖為含有重組酶FLP基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-FLP圖為選擇標(biāo)記基因兩側(cè)帶有同向frt位點(diǎn)的植物表達(dá)載體Fi曬g.差E母nz練ym喂e槐di撿ge壟st占ed精c機(jī)ha妻r(nóng)a旋ct撫er營(yíng)iz財(cái)at朋io窗n關(guān)ofpC嶄AM禁BI拔A1艘30肝0-宵an肝ti數(shù)po快rt愈-f斯rt獄1-刪al供s-征fr勁t21,開(kāi)p賀CA科MB紅IA錢(qián)13明00錦-a月nt旁ip遵or草t-冷fr蒼t1貓-a犁ls未-f寶rt武2/Xb憑aⅠ2,踢p魄CA劇MB據(jù)IA釣13壘00辦-a襲nt文ip凍or歲t-悶fr迎t1蛋-a笨ls肝-f聲r(shí)t抬2/Ba國(guó)mHⅠ3,pC佳AM搖BI束A1莊30憲0-掃cd波h縮慧-f糧rt頑1-遵al涌s-便fr擺t2棒/Ba蹲mHⅠ4,pC唐AM然BI滑A1在30方0-腫an方ti乘po喘rt斃-f痕rt育1-雹al廚s-店fr詠t2休/Xh岔oⅠ5,pC溜AM疑BI匹A1悉30梳0-寧an單ti柴po經(jīng)rt狹-f危rt旱1-央al能s-指fr鴿t2迅/Ec灰oRⅠ6,λ/蕩Ec罪oT晌14綱;棒7逐,縱DL改20翼00Fi眼g.睬E武nz捕ym敵e炕di延ge袋st瀉ed女c羅ha溫ra逃ct茄er訊iz些at環(huán)io膨nofpC翁AM裂BI幫A1自30倍0-椅fl醋p-汁h(huán)p屈t1,pC中AM丹BI紋A1仇30繡0-吐fl脆p-街hp星t/撿Hi皮ndⅢ2,伐p吐CA起MB貪IA拿13障00麥-f處lp請(qǐng)-h墾pt寧/E敏co讀RⅠ3,府p利CA忙MB服IA莫13肆00桐-f之lp秩-h齊pt孔/B怨am亦HⅠ+K條pnⅠ4,琴D符L2尼00世0其中，pC興AM嶄BI墨A1直30暴0-怒35驗(yàn)S-購(gòu)fl預(yù)p-課hp糊t、緞pC凈AM趙BI竹A1疫30綢0-3駁5S毅-a艷nt趙ip猛or版t-哭fr歷t1-a稼ls案-f竊rt2以及pC奇AM飾BI如A1啦30今0-餓35灰S-停CD拿H-燃fr照t1-a羨ls贏-f傾rt2三種把植物框表達(dá)殘載體悶已經(jīng)篩轉(zhuǎn)化影煙草它并且煮得到時(shí)了陽(yáng)礦性植職株；通過(guò)教二次專(zhuān)轉(zhuǎn)化示和共交轉(zhuǎn)化擾的方報(bào)法在飛煙草款中鑒愚定了FL揉P/fr陽(yáng)t定點(diǎn)姻重組符系統(tǒng)圈的功宰能，炮得到披了去晃除選趣擇標(biāo)癥記基因效僅帶熱目的曉基因秧的煙探草植充株?duì)?；Fig:PCRassayforantiport

ofthetransgenictobaccoplantlets1,resultfromplasmidDNA;2,3,transgenicplants;4,untransformedplant;5,DL2000

Fig:PCRassayforFLP

ofthetransgenictobaccoplantlets1,untransformedplant;2,DL2000;3-8,transgenicplants;9,resultfromplasmidDNA.Fig1:PCRassayforantiportoftheco-transgenictobaccoplantlets1,DL2000;2,resultfromplasmidDNA,3,4,untransformedplant;5-7,co-transgenicplants.Fig2:PCRassayforFLPoftheco-transgenictobaccoplantlets1,resultfromplasmidDNA;2,co-transgenicplants;3,DL20004,untransformedplant.Fig3:PCRassayforoftheco-transgenictobaccoplantlets1,co-transgenicplants;2,untransformedplant;3,resultfromplasmidDNA4,DL2000

將pE漢T-繭42適-b消(+饅)-趣FL布P原核款表達(dá)守載體弄轉(zhuǎn)入E.co待li的DE窯3(菜BL乳21疏)株系蝦中并印進(jìn)行燒表達(dá)骨，通藍(lán)過(guò)SD瞎S-水PA浮GE電泳參得到散了表薪達(dá)的FL掀P重組理酶的48KD鋒a的目點(diǎn)的條袖帶。工作鄉(xiāng)豐計(jì)劃以：構(gòu)建植物繞表達(dá)掃載體:pC康A(chǔ)M昌BI狂A1票30覺(jué)0-Ub西iq路ut盞in-f搭lp嘉-b胳ar奏(U們FB貨)pC額AM倉(cāng)BI匪A1擋30窗0-Ac鼓ti獻(xiàn)n-an晶ti樓po刊rt-f修r(nóng)t1-al孫s-辜fr卷t2(A類(lèi)AF留A)pC運(yùn)AM表BI濫A1送30襪0-Ub羊iq羽ut伙in-P福Pa雀se調(diào)-f潤(rùn)rt1-a耀ls炊-f糠rt2(U溪PF片A)轉(zhuǎn)化昂玉米燈芽尖勵(lì)及愈非傷組乏織，血成苗薯后經(jīng)烤分子景生物河學(xué)檢攤測(cè)得斯到轉(zhuǎn)季基因塊陽(yáng)性賢植株芝，然躁后通辨過(guò)二倉(cāng)次轉(zhuǎn)閃化或夾有性散雜交菊的方測(cè)法獲得昆去除骨選擇標(biāo)記訂基因謎的玉躲米轉(zhuǎn)吊基因嗎陽(yáng)性帝植株奏。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米芽尖和愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化植株

PCR檢測(cè)AAFA陽(yáng)性植株UFB陽(yáng)性植株UPFA陽(yáng)性植株有性雜交自交有性雜交AT1FT1PT1PCR檢測(cè)PCR檢測(cè)去除選擇標(biāo)記基因的去除選擇標(biāo)記基因的陽(yáng)性植株進(jìn)行Southern陽(yáng)性植株進(jìn)行SouthernNorthernblot檢測(cè)Northernblot檢測(cè)去除圍選擇新標(biāo)記卵基因帖的基運(yùn)因聚境合玉償米植洲株的融獲得鹽：在獲僅得去慎除選縮慧擇標(biāo)情記基因位的轉(zhuǎn)逼單基潤(rùn)因的體陽(yáng)性午植往株基爹礎(chǔ)上偏，使禮帶有處單吼基因熟的植閃株之喜間進(jìn)孝行有渾性狡雜交膜，篩袍選后殊代以必獲六得基嶺因聚秘合的么陽(yáng)性旁植株喇；AT1陽(yáng)性植株x

PT1陽(yáng)性植株APT2PCR檢測(cè)對(duì)去除選擇標(biāo)記基因而含有兩種目的基因的陽(yáng)性植株進(jìn)行SouthernNorthernblot檢測(cè)在得撫到轉(zhuǎn)較單基駁因的勺陽(yáng)性清植株蠟基礎(chǔ)貞之上系，進(jìn)申行二直次轉(zhuǎn)答化或秘者有漢性雜校交，礦對(duì)其斥后代朱進(jìn)行番分子裁生物遼學(xué)檢鍵測(cè)，膠得到膝含有峽兩個(gè)骨目的施基因積的陽(yáng)騾性植眠株，福將其堵與含墊有FL哈P重組帶酶的禾陽(yáng)性暗植株辦進(jìn)行舍有性黑雜交懸，經(jīng)薄過(guò)檢旗測(cè)可耐以得臺(tái)到去票除選枯擇標(biāo)肚記基杜因的堵基因摘聚合這植株瞧；AAFA陽(yáng)性植株xUPFA陽(yáng)性植株APT1PCR檢測(cè)含有兩種目的基因的陽(yáng)性植株SouthernNorthernblot檢測(cè)PCR檢測(cè)對(duì)去除選擇標(biāo)記基因而含有兩種目的基因的陽(yáng)性植株進(jìn)行SouthernNorthernblot檢測(cè)

xFT1在獲背得去別除選謹(jǐn)擇標(biāo)蛙記基幣因的缸轉(zhuǎn)單售基因辛的陽(yáng)拾性植蓬株后疾，利故用二蚊次轉(zhuǎn)痕化或增有性鮮雜交掩的方載法將位第二弊個(gè)目學(xué)的基此因(基其選猛擇標(biāo)巷記基垮因的嘩兩側(cè)必帶有作同向超的fr浪t位點(diǎn)笛)導(dǎo)塑入，酬在原浴陽(yáng)性藥植株乞中的FL凍P重組旋酶的夕作用蓬下將浮帶有仇第二勝個(gè)目效的基冊(cè)因的邀表達(dá)其載體濫中的樂(lè)選擇杯標(biāo)記惰基因睛去除姨，同窯時(shí)實(shí)摧現(xiàn)目炎的基即因的分聚合染。PT1陽(yáng)性植株xAAFA陽(yáng)性植株(AT1陽(yáng)性植株)(UPFA陽(yáng)性植株)APT2'PCR檢測(cè)對(duì)去除選擇標(biāo)記基因而含有兩種目的基因的陽(yáng)性植株進(jìn)行SouthernNorthernblot檢測(cè)構(gòu)建植物螺表達(dá)昆載體:pC廳AM壺BI跨A1擱30竟0-hs授p-f堵lp丘-b或ar轉(zhuǎn)化罰玉米度芽尖腸及愈筐傷組厲織，錘成苗擾后經(jīng)濟(jì)分子假生物擾學(xué)檢哄測(cè)得雜到轉(zhuǎn)翠基因盛陽(yáng)性寬植株數(shù)，通硬過(guò)在奏不同爽時(shí)期紅，不界同溫過(guò)度條泊件下體對(duì)植貼株的浩不同遠(yuǎn)部位活進(jìn)行裳熱激冬，誘耗導(dǎo)由孤熱誘馳導(dǎo)啟槽動(dòng)子兔啟動(dòng)隙的重沸組酶FL施P的表盆達(dá)，檢測(cè)嫂該酶罵的表鴿達(dá)水猴平，準(zhǔn)以確呢定誘偉導(dǎo)重嚼組酶觸表達(dá)銹的最野佳條栗件。探索壞重組村酶作長(zhǎng)用位煌點(diǎn)fr系t的長(zhǎng)示度及允串聯(lián)環(huán)個(gè)數(shù)保對(duì)重稱(chēng)組寧效率瓣的影灑響：構(gòu)建注不同則長(zhǎng)度臭的位猛點(diǎn)序介列的兼兩串降聯(lián)重寺復(fù)和眾三串么聯(lián)剛重復(fù)歌：fr鍋t1:78架bpfr題t2:78個(gè)bpfr少t1:96菠bpfr讓t2:96唇bpfr唉t1:11未7b度pfr鏟t2:14房誠(chéng)4b停p將這飲些成譽(yù)對(duì)的毯位點(diǎn)守序列陽(yáng)置于應(yīng)需要濾刪除粥的基把因兩積側(cè)，答重組響質(zhì)粒濱后轉(zhuǎn)愁入E.co籮li，提取這質(zhì)粒雀鑒定倉(cāng)后，杜將質(zhì)郵粒與純化燃的FL賓P重組鵲酶共同惠孵育監(jiān)，檢抱測(cè)重雕組事碎件是格否發(fā)甘生。一點(diǎn)肚設(shè)想洽：在獲瓣得去景除選舟擇標(biāo)蓋記基紋因的旗轉(zhuǎn)單升基因瞞的陽(yáng)葡性幅植株A基礎(chǔ)繭上，推構(gòu)建蔬帶有吹不同活目的青基因志的植倆物表蝴達(dá)載監(jiān)體B，使B僅在估目的攝基因愉的一旨側(cè)帶蔑有單謀一fr韻t位點(diǎn)幅，然歡后用做植物捉表達(dá)跡載體B對(duì)A進(jìn)行柿二次意轉(zhuǎn)化磁，期盛望A中的FL寶P重組撒酶仍喇然發(fā)劃揮作抹用，像催化雕兩個(gè)fr蓬t位點(diǎn)梅之間蛾的重紋組。逃經(jīng)過(guò)叫檢測(cè)終，也盞許可具以拿展到含潤(rùn)有兩匯個(gè)目楊的基捉因，燙而不妨含標(biāo)化記基象因的桃陽(yáng)性脊植株莖。請(qǐng)各器位老議師批島評(píng)指趨正！釀酒接酵母姜中廣糖泛存絕在的數(shù)2μ環(huán)是猛雙鏈萄環(huán)狀長(zhǎng)的DN冰A質(zhì)粒暢,其農(nóng)結(jié)構(gòu)婦上最伯為顯晃著的煎特點(diǎn)同是存淹在兩酒個(gè)5思99bp的反奮向重脫復(fù)序意列(IR歷)。這兩欄個(gè)IR序列拿之間盡容易熊發(fā)生寇重組夸,使科2μ環(huán)在香酵母伐細(xì)胞鑒中存叫在A和B兩種濟(jì)不同蹤蝶的構(gòu)居型,植并且腸對(duì)于享2μ環(huán)在喊酵母相細(xì)胞制中維勞持高葛拷貝彼數(shù)具秒有十嗽分重脖要的采作用工。2μ環(huán)分踩子內(nèi)抵發(fā)生脫的DN慎A重組估屬于痛位點(diǎn)孫特異貌性重倍組,擾由2μ環(huán)自智身編尼碼的FL施P重組雪酶催亮化。FL約P重組衫酶作院用的叉靶序嘆列為娃2μ環(huán)的秤兩個(gè)IR序列敗中4蒜8bp的FR須T位點(diǎn)翠,FR顆T位點(diǎn)厘由3拴個(gè)1于3bp的FL恩P重組漫酶結(jié)侮合區(qū)極和一符個(gè)跨住越Xb懼aI位點(diǎn)廊的8bp間隔膜區(qū)所將組成基。FL蟲(chóng)P重組謀酶可關(guān)以介屋導(dǎo)三袖種類(lèi)耳型的DN宵A重組發(fā)反應(yīng)濱:當(dāng)兩拿個(gè)FR緞T位點(diǎn)塘位于賭同一病條DN巡壽A分子頸上,乒且為厚順向寄排列藍(lán)時(shí),資重組稅的結(jié)胞果會(huì)完導(dǎo)致糕兩個(gè)FR燥T位點(diǎn)媽之間屆的DN榨A片段貪被切兩離;當(dāng)兩姻個(gè)FR纏T位點(diǎn)銀反向鋸排列底時(shí),如重組授的結(jié)胳果則爪導(dǎo)致盟兩個(gè)FR璃T位點(diǎn)犧之間布的DN懸A片段動(dòng)發(fā)生絞倒位填;當(dāng)兩雕個(gè)FR鏡T位點(diǎn)滋分別耐位于辣兩條DN慮A分子仍上時(shí)摩,重痛組的猴結(jié)果晃則導(dǎo)宗致DN挑A發(fā)生見(jiàn)相互集易位盡。Th姿e俱pr燭in漫ci紛pl永e練of飾C刺o-漢tr時(shí)an掛sf千or將ma劈燕ti反onA桌pr度op虜or拖ti脾on弄o愈f角t抖ra號(hào)ns尾fo朗rm枯ed義p聽(tīng)la李nt攪sca儉rr嫌yi肯ng徒t送he判s椅el尊ec饑ta啞bl感e洞ma溫rk們er反g凱en墓e閉wi靈llal藥so罵h薄av所e捉in宋te智gr衫at煮ed器t歲he體r慨eq蓮ui卡re飽d么in屢te羨re昌stge鎮(zhèn)ne呆a公t搭a戲se熟co良nd渡u貢nl蓬in躲ke改d共in湊se忌rt辣io神n革si燒te若.Ma矩rk墻er戀g勺en閘es磨c岡an漆b禿e捷re找mo苦ve沒(méi)d傾byge尸ne幕ti蛾c黃s憂(yōu)eg章re遷ga底ti意on冤.ShortageTheco-transformedsystemCannotbeusedforvegetativelypropagatedplantsCannotbeusedforplantswithlonggenerationtimesTimeconsumingTh登e列st躲ra前te俯gy編o妄f周tr拔an棍sp麥os姻ab指le總e晨le捷me松nt岡-b其as辰ed揉s取ys供te闖mCo晚nn事ec乘ti居ng轉(zhuǎn)e少it穗he籃r外th擋e貿(mào)in咱te雜re景st類(lèi)g杏en罪e之or許t竿he的s竄el恰ec寬ta供bl獄e餃ma阻rk羅er短w驅(qū)it園h送tr越an莊sp省os論ab廳le歇s眉eq屬u(mài)e刃nc縣es弄i滋n挽su肉ch僅a俗w抄ay詢(xún)t暫ha保t廳th昏e賴(lài)tw喝o橫en勻ti滑ti瘋es推c秘an沈b夸e含se瞎pa炎ra健te戶(hù)d仆fr塌om劃e疲ac燒h固ot曬he茄r番in暑a詠c盼on賠tr嗎ol忽le哀d淘re俘ac爬ti紋on誰(shuí)a旱ft贈(zèng)er什t切ra仿ns炎fo瞞rm厲at振io候n深an錄d挑se各le艷ct消io蒜n.Ma尺rk走er躲g貌en墊es耀c主an河b窗e陰re繭mo疫ve湖d漿by垮g埋en鴨et訊ic雅se妄gr裙eg樂(lè)at玻io榨n.Di薪sa責(zé)dv竹an穗ta險(xiǎn)geLo乎w替fr授eq缺ue討n(yōu)c尸yTh誦e刊lo賢w丑fr葉eq快ue咐nc削ie腰s項(xiàng)pa俊rt型ly蠟d雷u(yù)e么t泛o眼th氏e餐te帳nd覽en鬼cy紋o忙ftr后an悲sp埋os姨ab曠le毛e們le教me綁nt血s向to垃r納ei霉ns竹er無(wú)t員el縱se貢wh挎er榮e耀in馬t道he高g尚en灰om綠e.Ge金no魯mi昂c逼in府st撈ab歸il租it嚷yEx財(cái)ci鏈si責(zé)on拳o講ftr維an至sp叉os賭on灣sis晨f確re沸qu搏en魯tl鏈y(cè)堆im御pr代ec喉is懇eRe妄pe煮at已ed忽c堪yc舊le鉆s附