儀器分析液相色譜法

儀器分析液相色譜法第一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五簡(jiǎn)介最早發(fā)明的色譜法（俄國(guó)植物學(xué)家分離植物色素）直到1960年代后期才普及，因?yàn)槭艿讲牧虾拖鄳?yīng)技術(shù)的限制實(shí)現(xiàn)了高速化，HPLC（highperformanceliquidchromatographyorhighpressureLC)和GC相比液體流動(dòng)相選擇余地大，可以用以控制和改進(jìn)分離條件通常在常溫下進(jìn)行對(duì)象范圍大（80%的有機(jī)物）目前運(yùn)用最廣最多的色譜第二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五

1．高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法

高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點(diǎn)在于高速、高效、高靈敏度、高自動(dòng)化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá)103cm·min-1.例如分離苯的羥基化合物，7個(gè)組分只需1min就可完成。對(duì)氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長(zhǎng)約170cm，柱徑0.9cm，流動(dòng)相速度為30cm3·h-1，需用20多小時(shí)才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需1h之內(nèi)即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個(gè)組分.第三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五2．高效液相色譜法與氣相色譜法

（1）氣相色譜法分析對(duì)象只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20％。對(duì)于占有機(jī)物總數(shù)近80％的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析。

(2)氣相色譜采用流動(dòng)相是惰性氣體，它對(duì)組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運(yùn)載作用。而高效液相色譜法中流動(dòng)相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對(duì)組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對(duì)組分作用的劇烈競(jìng)爭(zhēng)。因此，流動(dòng)相對(duì)分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個(gè)控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。第四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五(3)氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而高效液相色譜法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作?？傊咝б合嗌V法是吸取了氣相色譜與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點(diǎn)，并用現(xiàn)代化手段加以改進(jìn)，因此得到迅猛的發(fā)展。目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對(duì)生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。高效液相色譜法的儀器設(shè)備費(fèi)用昂貴，操作嚴(yán)格，這是它的主要缺點(diǎn)。第五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五HPLC儀器第六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五HPLC和經(jīng)典LCClassicLC：重力洗脫HPLC：高壓、高效、高速第七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五HPLC儀器組成第八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五HPLC——高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性梯度淋洗裝置特別需要用于組分復(fù)雜、容量因子寬的樣品第九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五HPLC——進(jìn)樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：第十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五HPLC——分離柱柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。柱子裝填得好壞對(duì)柱效影響很大。對(duì)于細(xì)粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。第十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五HPLC——檢測(cè)器Detector理想的HPLC檢測(cè)器要求靈敏度高對(duì)所有的溶質(zhì)都有快速響應(yīng)響應(yīng)對(duì)流動(dòng)相流量和溫度變化不敏感不引起柱外譜帶擴(kuò)展線性范圍寬使用范圍廣至今沒有一種檢測(cè)器能夠類似于GC中的TCD和FID，做到以上的這些要求。第十二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五

在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測(cè)器。一類是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等。另一類是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有示差折光，電導(dǎo)檢測(cè)器等。HPLC——檢測(cè)器Detector第十三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五HPLC——UVdetector紫外（可見）吸收檢測(cè)器：UVD應(yīng)用最廣（70%）需要組分對(duì)紫外光（可見光）有吸收固定波長(zhǎng)，可調(diào)波長(zhǎng)，光電二極管陣列三類特點(diǎn)：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長(zhǎng)可選，易于操作；可用于梯度洗脫。第十四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五HPLC——FluorescenceDetector熒光檢測(cè)器（FD）選擇性濃度型高靈敏度，高選擇性對(duì)象發(fā)射熒光的物質(zhì)利用熒光試劑修飾的物質(zhì)比UVD檢測(cè)靈敏度高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到10-12~10-13g/cm3可以梯度淋洗一般用于檢測(cè)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等第十五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五HPLC——示差折光檢測(cè)器differentialrefractiveindexdetector通過連續(xù)檢測(cè)參比池和測(cè)量池中溶液的折射率（refractiveindex）的差別來測(cè)定濃度的。通用型檢測(cè)器檢測(cè)的化合物范圍廣檢測(cè)靈敏度在10-7g/cm3缺點(diǎn)是對(duì)溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗有反射、偏轉(zhuǎn)和干涉三種類型第十六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五HPLC——其他檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器選擇性檢測(cè)器在離子色譜儀中應(yīng)用最多缺點(diǎn)是受溫度影響大，而且在pH>7時(shí)不靈敏蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器根據(jù)不蒸發(fā)的溶質(zhì)微小顆粒對(duì)激光的散射來檢測(cè)只跟溶質(zhì)顆粒的大小和數(shù)量有關(guān)，與溶質(zhì)的化學(xué)組成無光不能鑒別化學(xué)成分第十七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五HPLC中的固定相和流動(dòng)相stationaryphaseandmobilephase第十八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五Stationaryphase固定相需要承受高壓，按承受高壓能力分剛性固體，以SiO2為基質(zhì)，應(yīng)用最廣泛，可以通過鍵合擴(kuò)大應(yīng)用范圍硬膠，由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成按孔隙深度分類表面多孔型：多孔層厚度小，孔淺，相對(duì)死體積小，出峰迅速柱效高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時(shí)迅速達(dá)平衡，適合做常規(guī)分析。但最大允許量受限。全多孔微粒型：由硅膠微粒凝聚而成。由于顆粒很細(xì)，孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速，適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。第十九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五Mobilephase流動(dòng)相由于高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它對(duì)組分有親和力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)。因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是：（1）溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑要與檢測(cè)器匹配。對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器，應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比溶劑的紫外截止波長(zhǎng)要長(zhǎng)。所謂溶劑的紫外截止波長(zhǎng)指當(dāng)小于截止波長(zhǎng)的輻射通過溶劑時(shí)，溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測(cè)量。對(duì)于折光率檢測(cè)器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)最高靈敏度。第二十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五Mobilephase流動(dòng)相（3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長(zhǎng)值增加50～1OOnm。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。（5）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離.第二十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五HPLC的主要類型和原理Basicprincipleandmaintypes第二十二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五主要類型液固吸附色譜液液分配色譜化學(xué)鍵合色譜尺寸排阻色譜親和色譜離子色譜第二十三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五一、液固吸附色譜（LSAC）

液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實(shí)質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進(jìn)行分離的。原理：

X+nSad=Xad+nS達(dá)平衡時(shí),有其中Kad為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難于洗脫。Kad值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。Kad值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。第二十四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五LSAC——固定相

吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，如線性容量較高，機(jī)械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多。在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小。孔穴淺的優(yōu)點(diǎn)，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。第二十五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五LSAC——流動(dòng)相

一般把吸附色譜中流動(dòng)相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對(duì)極性大的試樣往往采用極性強(qiáng)的洗脫劑；對(duì)極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強(qiáng)弱可用溶劑強(qiáng)度參數(shù)（ε0）來衡量。ε0越大，表示洗脫劑的極性越強(qiáng)。表14-6列出一些常用溶劑在氧化鋁吸附劑中的ε0值。在硅膠吸附劑中ε0值的順序相同，數(shù)值可換算（ε0硅膠=0·77×ε0氧化鋁）。第二十六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五二、液液分配色譜（LLPC）

在液-液色譜中,流動(dòng)相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。分離原理：液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。第二十七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五LLPC——固定相

由于液液色譜中流動(dòng)相參與選擇競(jìng)爭(zhēng)，因此，對(duì)固定相選擇較簡(jiǎn)單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。例如，最常用的強(qiáng)極性固定液β，β′一氧二丙睛，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊?fù)榈取?/p>

為了更好解決固定液在載體上流失問題。產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相。它是將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機(jī)械涂漬，因此它的產(chǎn)生對(duì)液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以認(rèn)為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個(gè)重大突破。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有3/4以上的分離問題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。

第二十八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五LLPC——流動(dòng)相

在液液色譜中為了避免固定液的流失。對(duì)流動(dòng)相的一個(gè)基本要求是流動(dòng)相盡可能不與固定相互溶，而且流動(dòng)相與固定相的極性差別越顯著越好。正向分配色譜：流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，用于分離極性化合物。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。反向分配色譜：流動(dòng)相的極性大于固定相的極性，用于分離非極性化合物。其流出順序與正相色譜恰好相反。第二十九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五三、化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）

采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜。由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團(tuán)可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機(jī)分子成鍵,即可得到各種性能的固定相?；鶊F(tuán)類型有：疏水基團(tuán)：不同鏈長(zhǎng)的烷烴和苯基等極性基團(tuán)：醚和醇、氨丙基、氰乙基等離子交換基團(tuán)：陰離子交換基團(tuán)的氨基、季銨鹽；陽離子交換基團(tuán)的磺酸基等第三十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五CBPC——固定相的制備硅酸酯（≡Si一OR）鍵合固定相 ≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20由于這類鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體，具有良好的傳質(zhì)特性,但這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流動(dòng)相?！許i－C或Si一N共價(jià)鍵合固定相共價(jià)鍵健合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點(diǎn)是格氏反應(yīng)不方便；當(dāng)使用水溶液時(shí)，必須限制pH在4～8范圍內(nèi).第三十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五CBPC——固定相的制備硅烷化（≡Si—O－Si－C）鍵合固定相這類鍵會(huì)固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)。能在70℃以下，PH=2～8范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用較廣泛.第三十二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五CBPC——正相鍵合相色譜法

此法是以極性的有機(jī)基團(tuán)，CN、NH2雙羥基等鍵合在硅膠表面，作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙晴.等）為流動(dòng)相，分離極性化合物。此時(shí)，組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，但隨流動(dòng)相極性的增加而降低。這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。第三十三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五CBPC——反相鍵合相色譜法

此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相流動(dòng)相是采用極性較強(qiáng)的溶劑它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；若采用含一定比例的甲醇或乙睛的水溶液為流動(dòng)相，也可用于分離極性化合物；若采用水和無機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相，則可分離一些易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類等。反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn)。第三十四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五四、尺寸排阻色譜法（SEC）sizeexclusionchromatography尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實(shí)現(xiàn)分離的。廣泛應(yīng)用于大分子的分級(jí)，具有其他LC法所沒有的特點(diǎn)：保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù)，可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息保留時(shí)間短，譜峰窄，易檢測(cè)，可采用靈敏度較低的檢測(cè)器固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強(qiáng)保留分子，因此柱壽命長(zhǎng)。第三十五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五SEC——分離原理（分子篩效應(yīng)）其固定相為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)——凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。。第三十六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五SEC——固定相固定相凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。

（1）軟性凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動(dòng)相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。（2）半剛性凝膠如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。用于高效液相色譜時(shí)，流速不宜大。（3）剛性凝膠如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作。一般控制壓強(qiáng)小于7MPa，流速＜1cm3·s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。第三十七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五SEC——流動(dòng)相排阻色譜所選用的流動(dòng)相必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤(rùn)濕凝膠。當(dāng)采用軟性凝膠時(shí)，溶劑也必須能溶脹凝膠。溶劑的粘度要小，因?yàn)楦哒扯热軇┩拗品肿訑U(kuò)散作用而影響分離效果。這對(duì)于具有低擴(kuò)散系數(shù)的大分子物質(zhì)分離，尤需注意。選擇溶劑還必須與檢定器相匹配。常用的流動(dòng)相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。以水溶液為流動(dòng)相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。第三十八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五五、親和色譜法（AC）Affinitychromatography利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離通常是在載體（無機(jī)或有機(jī)填料）表面先鍵合一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂（如環(huán)氧、聯(lián)氨等）；隨后，再連接上配基（酶、抗原或激素等）這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，沒有這種作用的分子不被保留。第三十九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五六、離子色譜法（IC）Ionchromatography由離子交換色譜法派生出來，用于檢測(cè)分離離子性物質(zhì)1975年Small等人實(shí)現(xiàn)的單柱離子色譜法（singlecolumnICornon-suppressedIC）和雙柱離子色譜法（doublecolumnIC

orsuppressedIC）特點(diǎn)：分析速度快，檢測(cè)靈敏度高，選擇性好，多離子可以同時(shí)分析，穩(wěn)定性高是離子性物質(zhì)，特別是無機(jī)陰離子的最佳分離分析方法第四十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五IC——分類按分離機(jī)理分成許多類，同時(shí)結(jié)合正相反相組成了更多種的離子色譜法。以下幾種為比較常用的：離子交換色譜法（ionexchangechromatography,IEC)電場(chǎng)相互作用+非離子性的吸附過程離子排斥色譜法（ionchromatographyexclusion,ICE）Donnan膜平衡、體積排阻和分配過程離子對(duì)色譜法（ionpairchromatography,IPC）吸附與分配具體的介紹可以參考書本或其他的資料。第四十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五IC儀器的基本構(gòu)成以上為抑制型，，去掉抑制器、再生液和再生泵則為非抑制型第四十二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五各種液相色譜法的比較第四十三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五HPLC條件和類型的選擇第四十四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五影響HPLC分離效果的因素在高效液相色譜中,液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u較小，可以忽略不計(jì)，即：H=A+Cu故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。恒溫改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。第四十五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五影響HPLC分離效果的因素流速大于0.5cm/s時(shí),

H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。第四十六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五分離類型的選擇1．根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量選擇相對(duì)分子質(zhì)量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。標(biāo)準(zhǔn)液相色譜類型（液一固、液一液、及離子交換色譜）最適合的相對(duì)分子質(zhì)量范圍是20O～2000。對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量大于2000的樣品，則用尺寸排阻法為最佳。第四十七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五2．根據(jù)溶解度選擇

弄清樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度是很有用的。如果樣品可溶于水井屬于能離解物質(zhì)，以采用離子交換色譜為佳；如樣品可溶于烴類（如苯或異辛烷），則可采

用液一固吸附色譜；如樣品溶解于四氯化碳，則多采用常規(guī)的分配和吸附色譜分離；如樣品既溶于水又溶于異丙醇時(shí)，常用水和異丙醇的混合液作液一液分配色譜的流動(dòng)相，以憎水性化合物作固定相。第四十八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五3．根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇用紅外光譜法，可預(yù)先簡(jiǎn)單地判斷樣品中存在什么官能團(tuán)。然后，確定采用什么方法合適。例如，酸、堿化合物用離子交換色譜；脂肪族或芳香族用液一液分配色譜、液一固吸附色譜；異構(gòu)體用液一固吸附色譜；同系物不同官能團(tuán)及強(qiáng)氫鍵的用液一液分配色譜。第四十九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五HPLC分離類型選擇第五十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五HPLC的應(yīng)用

1.環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析

固定相：薄殼型硅膠(37～50m)

流動(dòng)相：正己烷流速：1.5mL/min

色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)

檢測(cè)器：差示折光檢測(cè)器

可對(duì)水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。第五十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五2.稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動(dòng)相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC

柱壓：70104Pa

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器第五十二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五超臨界流體色譜法（SFC）Supercriticalfluidchromatography第五十三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五超臨界流體色譜法

超臨界流體色譜法（SupercriticalFluidChromatography,SFC）是以超臨界流體作為流動(dòng)相的一種色譜方法。所謂超臨界流體，是指既不是氣體也不是液體的一些物質(zhì)，它們的物理性質(zhì)介于氣體和液體之間。超臨界流體色譜技術(shù)是2O世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種嶄新的色譜技術(shù)。由于它具有氣相和液相所沒有的優(yōu)點(diǎn)，并能分離和分析氣相和液相色譜不能解決的一些對(duì)象，應(yīng)用廣泛，發(fā)展十分迅速。據(jù)估計(jì)，至今約有全部分離的25％涉及難以對(duì)付的物質(zhì)，通過超臨界流體色譜能取得較為滿意的結(jié)果。第五十四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五一．超臨界流體的特性

(1)物質(zhì)的臨界點(diǎn)我們知道，某些純物質(zhì)具有三相點(diǎn)和臨界點(diǎn)。純物質(zhì)的相圖見圖20-s1由三相圖看出：物質(zhì)在三相點(diǎn)下，氣、液、固三態(tài)處于平衡狀態(tài)。而在物質(zhì)的超臨界溫度下，其氣相和液相具有相同的密度。當(dāng)處于臨界溫度以上，則不管施加多大壓力，氣體也不會(huì)液化。在臨界溫度和臨界壓力以上，物質(zhì)是以超臨界流體狀態(tài)存在。即在超臨界狀態(tài)下，隨溫度、壓力的升降，流體的密度會(huì)變化。此時(shí)的物質(zhì)既不是氣體也不是液體，卻始終保持為流體。臨界溫度通常高于物質(zhì)的沸點(diǎn)和三相點(diǎn)。第五十五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五

第五十六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五（2）超臨界流體的特性

超臨界流體具有對(duì)于分離極其有利的物理性質(zhì)。它們的這些性質(zhì)恰好介于氣體和液體之間。超臨界流體的擴(kuò)散系數(shù)和粘度接近于氣相色譜，因此溶質(zhì)的傳質(zhì)阻力小，可以獲得快速高效分離。另一方面，其密度與液相色譜類似，這樣就便于在較低溫度下分離和分析熱不穩(wěn)定性、相對(duì)分子質(zhì)量大的物質(zhì)。另外，超臨界流體的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)，如擴(kuò)散、粘度和溶劑力等，都是密度的函數(shù)。因此，只要改變流體的密度，就可以改變流體的性質(zhì)，從類似氣體到類似液體，無需通過氣液平衡曲線。超臨界流體色譜中的程序升密度相當(dāng)于氣相色譜中程序升溫度和液相色譜中的梯度淋洗。通常作為超臨界流體色譜流動(dòng)相的一些物質(zhì)，其物理性質(zhì)列在表20-1中。第五十七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五第五十八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五二．超臨界流體色譜儀

1985年出現(xiàn)第一臺(tái)商品型的超臨界流體色譜儀。很多部分類似于高效液相色譜儀，但有兩點(diǎn)重要差別：（l）具有一根恒溫的色譜柱。這點(diǎn)類似氣相色譜中的色譜柱，目的是為了提供對(duì)流動(dòng)相的精確溫度控制。（2）帶有一個(gè)限流器（或稱反壓裝置）。目的用以對(duì)柱維持一個(gè)合適的壓力，并且通過它使流體轉(zhuǎn)換為氣體后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)量。實(shí)際上，可把限流器看作柱末端延伸部分。第五十九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五1.Bergerp7500超臨界流體色譜儀第六十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五2.流程圖第六十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五3．壓力效應(yīng)

在SCF中，壓力的變化對(duì)容量因子k產(chǎn)生顯著影響，由于以超流體作為流動(dòng)相，它的密度隨壓力增加而增加，而密度的增加引起流動(dòng)相溶劑效率的提高，同時(shí)可縮短淋洗時(shí)間。例如，采用CO2流體作流動(dòng)相，當(dāng)壓力由7.O×106Pa增加到9．0×106Pa時(shí)，對(duì)于十六碳烷烴的淋洗時(shí)間可由25min縮短到5min。在SFC中，通過程序升壓實(shí)現(xiàn)了流體的程序升密，達(dá)到改善分離的目的。

第六十二頁，共六十八頁，編