第八章殘留農(nóng)藥檢測(cè)方法免疫法

第八章殘留農(nóng)藥的檢測(cè)方法

-免疫分析法一、免疫學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)1.抗原抗原（antigen,Ag）是一類能夠引起機(jī)體特異性免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)抗體或T細(xì)胞受體發(fā)生特異反應(yīng)的物質(zhì)?？乖哂幸韵聝煞N特性：①免疫原性，即誘導(dǎo)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或者激活淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力，具有這種特性的物質(zhì)稱為免疫原；

②抗原性（antigenicity)，指與抗體反應(yīng)的性質(zhì)，這種結(jié)合反應(yīng)具有特異性?？乖倪@兩種特性是不同的，具有免疫原性的物質(zhì)必然有抗原性，反之則不一定成立。具有上述兩種特性的物質(zhì)稱為完全抗原，只具有抗原性的物質(zhì)稱為半抗原，它能與抗體結(jié)合但不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答.2.抗體（antibody,Ab)機(jī)體受抗原刺激后，在體液中出現(xiàn)一種能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白，因其具有免疫活性，習(xí)慣上稱為免疫球蛋白.

4.抗原抗體反應(yīng)抗原與抗體相互作用是免疫學(xué)的基礎(chǔ)，二者通過(guò)大量非共價(jià)鍵連接，包括靜電力、氫鍵、疏水作用和范德華力等。抗原和抗體在體內(nèi)進(jìn)行的反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)，在體外進(jìn)行的反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)。5.免疫分析免疫分析方法是研究免疫學(xué)的工具。免疫分析是基于抗原抗體之間的特異性相互作用從而實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原、抗體或相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分析檢測(cè)的方法。免疫反應(yīng)的高選擇性、高親和性和高靈敏性為免疫分析的可靠和準(zhǔn)確提供了保證。從本質(zhì)上講，幾乎所有的免疫分析都是基于識(shí)別位點(diǎn)的占據(jù)率的測(cè)定，根據(jù)這種反應(yīng)性質(zhì)可分為競(jìng)爭(zhēng)免疫分析和非競(jìng)爭(zhēng)免疫分析。二、酶聯(lián)免疫吸附分析法1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）集抗原抗體反應(yīng)的高靈敏性和強(qiáng)特異性于一體，表現(xiàn)出簡(jiǎn)單、快速、靈敏和選擇性高等優(yōu)勢(shì)，在20世紀(jì)80年代得到了快速發(fā)展，尤其在農(nóng)藥殘留測(cè)定方面表現(xiàn)最為活躍。采用EIJSA法不僅可以定性，而且可以定量，使用多孔滴定板，一次可進(jìn)行大批量樣品的測(cè)定。已商品化的篩選農(nóng)藥殘留的EIASA試劑盒種類很多，不僅能用于各種食品和多種環(huán)境樣品中的殺蟲劑、殺菌劑、除草劑分析，而且也能檢測(cè)多種環(huán)境污染物，如多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴，以及黃曲霉素等多種天然毒素。ELISA一次只能檢測(cè)單一農(nóng)藥或結(jié)構(gòu)近似的少數(shù)幾種農(nóng)藥，不能解決農(nóng)藥多殘留分析問(wèn)題。而且抗體制備難度較大。目前抗體數(shù)量還較少；分析會(huì)受到特異性或非特異性的干擾；如果在不能肯定試樣中農(nóng)藥品種的情況下，檢測(cè)具有一定的盲目性；此外有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性現(xiàn)象等等。隨著技術(shù)的日趨成熟，ELISA在農(nóng)藥殘留速測(cè)中的應(yīng)用會(huì)得到新的發(fā)展。1.基本原理將抗原或抗體固定于合適的載體上，并保持其生物活性．使抗原或抗體與某種酶連接．這種酶標(biāo)抗原或抗體同時(shí)其有免疫活性和酶的活性；待測(cè)樣品和酶標(biāo)抗原或抗體與包被的抗原或抗體經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)；用洗滌的方法將固相載體上的復(fù)合物與其他物質(zhì)分離；加入酶反應(yīng)的底物，復(fù)合物上的酶催化底物使其水解，氧化或還原成有色產(chǎn)物，一定條件下，產(chǎn)物的色澤與待測(cè)物的含量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性或定量分析。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。底物顯色定性或定量的分析原理包被反應(yīng)加入待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。其所猾生成片的顏虹色深孤淺與幣欲測(cè)站的抗熱原（菊抗體并）含蛛量成嫩正比欄。這種銳有色泉產(chǎn)物鐮可用娘肉眼鉛、光槐學(xué)顯潤(rùn)微鏡桿、電膊子顯往微鏡坦觀察供，也渴可以輕用分即光光臭度計(jì)往（酶凡標(biāo)儀績(jī)）加駛以測(cè)代定。其方花法簡(jiǎn)階單，好方便擋訊速倘，特吩異性鉤強(qiáng)。酶結(jié)判合物蜓是酶鐵與抗飯?bào)w或棍抗原日、半誤抗原丹在交罩聯(lián)劑托作用肚下聯(lián)莫結(jié)的墳產(chǎn)物國(guó)。是EL偉IS蔑A成敗狗的關(guān)占鍵試教劑，艙它不揚(yáng)僅具姿有抗衛(wèi)體抗響原特啦異的翅免疫生反應(yīng)寨，還懲具有貪酶促么反應(yīng)鵲，顯艦示出叼生物來(lái)放大壓作用感，但競(jìng)不同圈的酶根選用段不同未的底垮物色，將槍得到劫不同哭的顏惕色反野應(yīng).酶底物顯色反應(yīng)

測(cè)定波長(zhǎng)

辣根過(guò)氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

3.猜E群LI誤SA方法艘的建廉立EL狼IS勢(shì)A方法黎的建錢立包才括待雕測(cè)農(nóng)腹藥、捆滴定圣板和聰酶的羨選擇瞇、半鞭抗原堤合成負(fù)、人鐵工抗予原合予成、獵抗體墊制備軟和樣聽(tīng)品前搶處理蠻方法場(chǎng)及質(zhì)睡量控舞制等唯。三、EL懼IS縫A應(yīng)用溉實(shí)例飼料良中鹽費(fèi)酸克綱倫特險(xiǎn)羅的柏測(cè)定飼料惠中毒貌素的負(fù)測(cè)定某（主暈要包重括黃喉曲霉啊毒素涌，銜簡(jiǎn)費(fèi)曲霉流毒素潔）飼料塞中有扣害微半生物距的快孔速篩浴檢蛇（如帳沙門然氏菌網(wǎng)）EL聯(lián)IS酷A在飼蘿料安毅全檢館測(cè)中匯的應(yīng)暖用甲胺殲磷殘郊留分圣析甲基狐對(duì)硫程磷殘紅留分其析呋喃么丹殘惱留分篩析EL晴IS奔A用于臉農(nóng)藥夕殘留所的檢核測(cè)主要米有除如草劑撫與殺到蟲劑臟兩大只類例如慮殺暝歇松（FN）、甲氟聽(tīng)磷酸售異已心酶（SO樣MA垃N）、草不浩綠（Al輝ac揮ho框r）、西維浮因（Ca抖rb塔ar沈yl）、多菌攻靈及滲克菌徑丹（Ca無(wú)pt即an）等晨。農(nóng)藥糧的檢膏測(cè)：快速EL土IS持A試劑愧盒EL榨IS期A試劑陪盒目俊前在病食品償檢測(cè)減、水眾產(chǎn)品掏檢測(cè)腐、動(dòng)春物檢副疫檢珠測(cè)和投農(nóng)藥蔬殘留東檢測(cè)嫁等方掉面已蒸得到濫了廣點(diǎn)泛的另應(yīng)用系。它極具有暫快速題、靈片敏度間高、芹測(cè)定首步驟辛簡(jiǎn)便熱、成紹本低喊、操種作安嶺全等次特點(diǎn)槍，完箏整的EL執(zhí)IS表A試劑菌盒包章含以艦下各頁(yè)組分六：斃①列包被猾抗原旁或抗遵體的歡固相屢載體諷；徑②賠酶標(biāo)細(xì)抗原近或抗愉體；焦③域酶濃的底萍物；午④服陰棗性和怠陽(yáng)性?shī)Z對(duì)照衫品（戀定性律測(cè)定別），食參考什標(biāo)準(zhǔn)督品和意控制件血清趟（定減量測(cè)帥定）作；告⑤系結(jié)合杯物及掛標(biāo)本執(zhí)的稀便釋液膜；端⑥您洗滌叢