生物蛋白純化

生物蛋白純化1引言:1]親和層析的原理是：生物分子間存在很多特異性的相互作用，它們之間都能夠?qū)Ｒ欢赡娴慕Y(jié)合，這種結(jié)合力就稱為親和力。親和層析就是通過將具有親和力的兩個分子中一個個固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進(jìn)行分離純化。被固定在基質(zhì)上的分子稱為配體，配體和基質(zhì)是共價結(jié)合的，構(gòu)成親和層析的固定相，稱為親和吸附劑。親和層析時首先選擇與待分離的生物大分子有親和力的物質(zhì)作為配體，并將配體共價結(jié)合在適當(dāng)?shù)牟蝗苄曰|(zhì)上。將制備的親和層析劑裝柱平衡，當(dāng)樣品溶液通過親和層析柱的時侯。待分離的生物分子就與配體發(fā)生特異性結(jié)合，從而留在固定相上；而其它雜質(zhì)不能與配體結(jié)合，仍在流動相中，并隨洗脫液流出，這樣層析柱中就只有待分離的生物分子。通過適當(dāng)?shù)南疵撘簩⑵鋸呐潴w上洗脫下來，就得到了純化的待分離物質(zhì)。親和層析的優(yōu)點(diǎn)是它分離蛋白經(jīng)常只需要經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜生物蛋白質(zhì)混合物中分離出來，而且純度很高。此外蛋白在純化過程中得到濃縮，結(jié)合到親和配基后，性質(zhì)更加穩(wěn)定，其結(jié)果提高了活性回收率。它可以減少純化步驟，縮短純化時間，對不穩(wěn)定的蛋白純化十分有利。2材料2.1材料和試劑2.1.1菌株與質(zhì)粒大腸桿菌BL21(DE3),Genscript保藏；表達(dá)載體pColdTF,Genscript保藏；pColdTF-Cementprotein，Genscript構(gòu)建。2.1.2主要試劑Ni-IDA親和層析凝膠：Genscript生產(chǎn)；LB液體培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白月東(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeastextract)5g/L氯化鈉(NaCl)5g/L,用NaOH調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的pH為7.4；氨卡青霉素溶液：50Pg/mL；IPTG：0.5mmol/L；Tris-HCl：50mM,PH8.0；蛋白Marker:TIANGEN公司，MP102；:Tris-HClTris-HCl：50mM,PH8.0；蛋白Marker:TIANGEN公司，MP102；:Tris-HClTris-HClTris-HClTris-HClLysisBufferWashBuffer1WashBuffer2ElutionBuffer洗滌緩沖液封閉液:50mM:50mM:50mM:50mM2]200mM；200mM；200mM；200mM；NaCl；pH8.0；NaCl ； 20mM 咪唑；NaCl ； 50mM 咪唑；NaCl ； 250mM 咪唑；pH8.0；pH8.0；pH8.0；:150mMPBS,0.5mLTween-20(0.13%),PH7.4；:脫脂奶粉(5%),PBS；蛋白電泳試劑：丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為上海生工公司產(chǎn)品;丙烯酰胺儲備液:30%(w/v)丙烯酰胺，0.8%(w/v)甲叉雙丙烯酰胺；丙烯酰胺29.2g,甲叉雙丙烯酰胺0.8g,加蒸餾水至100mL,用濾紙過濾后于棕色瓶中4°C存放；(1.5M/L,4C(1.5M/L,4C存放；(0.5M/L,pH8.8)：18.15gTris(分析純)，用1M/LHCl調(diào)節(jié)pH至8.8,加水至100mL,pH6.8)：6gTris，用pH6.8)：6gTris，用1M/LHCl調(diào)節(jié)pH至6.8,加水至100mL,6gTris,28.8g甘氨酸，2gSDS,6gTris,28.8g甘氨酸，2gSDS,加水至2L；加水定容至100mL，完全溶解后室溫存放；g過硫酸銨(分析純)，加1mL蒸餾水溶解；Tris-甘氨酸電泳緩沖液：SDS溶液(10%)：10gSDS,過硫酸銨溶液(10%)：0.15X樣品緩沖液：0.6mLTris-HCl緩沖液(1mol/L,pH6.8)、5mL50%(v/v)甘油、2mL10%SDS、0.5mL0一巰基乙醇、1mL1%(w/v)漠酚藍(lán)、0.9mL蒸餾水。4C存放；12%分離膠的配制：蒸餾水3.5mL,30%丙烯酰胺儲備液(A液)4mL,分離膠緩沖液(B液)2.5mL,10%過硫酸銨50閆，TEMED5閆；5%濃縮膠的配制：蒸餾水2.3mL，30%丙烯酰胺儲備液（A液）0.67mL，濃縮膠緩沖液（C液）1.0mL，10%過硫酸銨30閆，TEMED5M；考馬斯亮藍(lán)染色液：考馬斯亮藍(lán)R-2501g，甲醇450mL，冰醋酸100mL，蒸餾水450mL；脫色液：甲醇200mL，冰醋酸200mL，蒸餾水1600mL。封閉液：5%脫脂牛奶或者20%BSA2.1.3主要儀器PK-8D型電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）TH2-25大容量恒溫震蕩器（上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司）JY98-3D超聲細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）GL21K高速離心機(jī)（湖南湘儀儀器有限公司）HL-2恒流泵（上海滬西分析儀器廠）IHZD-3紫外檢測儀（上海滬西分析儀器廠）TH-300梯度混合器（上海滬西分析儀器廠）5414D型臺式高速離心機(jī)（美國Eppendrof公司產(chǎn)品）垂直板狀電泳系統(tǒng)（Bio-Rad公司產(chǎn)品）移液槍（DAIGGER）水浴鍋DK-8D（上海一恒儀器）3方法與步驟Cementprotein重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化】3〕1） 取重組質(zhì)粒；pColdTF-Cementprotein4閆于100M感受態(tài)細(xì)胞BL21中，冰浴30min；2） 42°C水浴熱激90s；3） 立即放置冰上冰浴3min；4） 加入600閆37C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，搖床震蕩培養(yǎng)30min；5） 12000rpm離心2min，棄400M培養(yǎng)基，剩約200M,混勻菌體，涂布平板（A+）,37C過夜培養(yǎng)；Cementprotein優(yōu)化與表達(dá)鑒定】4〕1） 取5支4mlLB試管培養(yǎng)基分別標(biāo)記對照、1、2、3。2） 其中對照中加入50ul葡萄糖，對照、1、2、3,分別加入4ulA+，從平板中挑取5個白色菌落。分別加入5支試管。3） 對照、1、2、37C搖床培養(yǎng)，待OD=0.6時，^口4ulIPTG，37C，誘導(dǎo)培養(yǎng)4h；4） 4號試管37C搖床培養(yǎng)，待OD=0.6時，^口2ulIPTG，15C，過夜誘導(dǎo)12h；5） 取4只EP管分別標(biāo)記對照、1、2、3。6） 從試管中取200ul菌體，依次加入￡?管中。7） 11000rpm,4min,4C離心4min,去上清。8） 沉淀用15MTris重懸；再加入15閆2XLoadingBuffer，沸水煮15min，離心，SDSD:5]電泳檢測。Cementprotein可溶性分析1） 取4支1.5mlEP管標(biāo)記1-沉淀、1-上清、3-沉淀、3-上清、取表達(dá)鑒定的1號管和3號管菌液分別加入1-沉淀、3-沉淀，5000rpm，3min，離心去上清，沉淀用200ulTris重懸。2） 超聲破碎冰水浴】6〕（間歇時間：3s;工作時間：3s；全程時間：10min；）。3）5000rpm，3min，離心，上清液分別倒入1-上清、3-上清中，1-沉淀、3-沉淀中沉淀用200ulTris重懸，4支EP管各加入200ul2XLoadingBuffer混勻沸水浴15分鐘。4） 4支EP管各取8ul進(jìn)行SDS檢測。Cementprotein擴(kuò)大培養(yǎng)1）接種，1%的接種量，接種到4mL液體LB培養(yǎng)基中，30C,200rpm，搖床培養(yǎng)過夜，即種子液；2） 轉(zhuǎn)接，4mL的種子液轉(zhuǎn)接到1LLB搖瓶，并向其中加入800M的A+，37C，180rpm搖床震蕩培養(yǎng)4h；3） 誘導(dǎo)，1L培養(yǎng)基加入400M的IPTG，于15C搖床內(nèi)，180rpm，過夜誘導(dǎo)12h；4） 收菌，7000rpm,7min,4C離心收集菌體，收集的菌體放于-20C備用。3.5蛋白RAC-22的純化:7]1.超聲破碎：1） 1L培養(yǎng)液菌體用30mLLysisBuffer重懸，將菌液置于冰水中，超聲破碎（間歇時間：3s;工作時間：3s；全程時間：15min；）；菌體分離：:8]1）破碎液11000RPM離心15分鐘。取上清。C.Ni柱純化蛋白1） 裝柱：將層析柱洗凈，用去離子水潤洗柱子及管道，用適量的Ni-IDA介質(zhì)（5ml）裝入層析柱中；2） 平衡：靜置完成后，用LysisBuffer平衡介質(zhì)至紫外檢測儀示數(shù)穩(wěn)定；3） 上樣：上清液以1ml/min的速度上樣；4） 洗雜：上樣完成后，先用LysisBuffer洗滌；而后用WashBuffer1洗滌雜蛋白全紫外檢測儀數(shù)值趨于穩(wěn)定。并收集樣品。標(biāo)記“20”。再用WashBuffer2洗滌至紫外檢測儀數(shù)值趨于穩(wěn)定。并收集樣品，標(biāo)記“50”。5） 洗脫：用ElutionBuffer洗脫目標(biāo)蛋白，當(dāng)紫外檢測儀的示數(shù)開始變化后，取20ul加入350ul的G250中觀察顏色變化。當(dāng)有G250由棕色變?yōu)樗{(lán)色時，開始收集流出液于無菌的塑料瓶中，洗脫直全樣品不再使G250變藍(lán)并紫外檢測儀示數(shù)不再下降。3.5.3透析]9]：1）取2000ml透析液，將洗脫所得的溶液裝入透析袋中，4°C，過夜透析12h，蛋白復(fù)性：將蛋白稀釋至10mg/ml,100ul/ml的速度加入20倍體積的0.1M磷酸鹽緩沖液.菌液于7000RPM,離心20分鐘.取上清。蛋白濃度和純度的檢測1） 蛋白濃度測定，取3mlG250,加入比色皿中。A調(diào)100%，T調(diào)零。取透析所得的蛋白溶液，50u】加入3MLG250中混勻，待分光光度計(jì)數(shù)值不再變化，記錄數(shù)值。2） 電泳檢測蛋白純度，將蛋白電泳圖片經(jīng)專業(yè)軟件測定蛋白純度。取樣，取10閆電泳。3.6.蛋白印記檢測（Westernblot）：10]3.6.1電泳1）取樣，取10M，SDS電泳。3.6.2轉(zhuǎn)膜1） 準(zhǔn)備4-6張濾紙和1張PVDF膜或NC膜。戴一次性PE手套，避免手上的蛋白污染膜。轉(zhuǎn)膜前，NC膜要置于去離子水中浸泡1min；PVDF膜應(yīng)在甲醇溶液中浸泡20min。2） 在轉(zhuǎn)移液里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒或滴管、濾紙和浸過的膜。3） 取出SDS膠將濃縮膠輕輕刮去。將膠在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5分鐘左右，以平衡離子強(qiáng)度。4） 打開平放底部黑色電極（陰極），放一張海綿墊片，搟氣泡。于海綿墊片上放翼-3張用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過的濾紙，逐張疊放，對齊，搟氣泡。取出浸在轉(zhuǎn)膜液中的凝膠平放于濾紙上，排除所有氣泡。將PVDF膜或NC膜置于聚丙烯酰胺凝膠上，排除所有氣泡。在膜上蓋上2-3張轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過的濾紙，排除所有氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，放上另一張或幾張海綿墊片，蓋上陽極板（白色），夾緊。保證對凝膠有一定的壓力。5） 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中。轉(zhuǎn)膜在冰上進(jìn)行，用磁力攪拌器攪拌。用恒壓60V或恒流200mA轉(zhuǎn)移2h-2h30min。3.6.3轉(zhuǎn)膜免疫反應(yīng)1） 取膜，將膜正面超上在PBST溶液中搖動五分鐘，移至含有封閉液的平皿中，室溫脫色搖床上4度靜置過夜。2） 取出膜在PBST溶液中洗5分鐘，放入含有一抗的PBST緩沖液中，室溫下孵育1.5h后，用PBST在室溫下脫色搖床上洗四次，每次5min；3） 膜放入含有二抗的PBST溶液中，室溫下孵育1.5h后，用PBST在室溫下脫色搖床上洗四次，每次5min；再用PBS洗二次，每次5min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。3.6.4化學(xué)發(fā)光，顯影，定影1）將入和B兩種試劑（Genscript公司HRP標(biāo)記的底物）在離心管中上等體積混合，避光保存；用紙巾吸去印跡膜邊緣或者邊角部分多余的液體，正面朝上置與平整的保鮮膜上，加上以上的A、B混合液2ml，使膜正面與液體充分接觸，避光靜置3分鐘；3min后，用紙巾吸去印跡膜邊緣或者邊角部分多余的液體，置與另一平整的保鮮膜上，包好，放入X-光片夾中。2）在暗室中，將1X顯影液和定影液各500ml分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X-光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大??；把X一光片放在膜上，關(guān)上X-光片夾，曝光3分鐘，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。立刻將X-光片浸入定影液中，定影10min，用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾十。4.結(jié)果與分析4.1.Cementprotein的表達(dá)鑒定:ii]挑取菌落至4mL培養(yǎng)基培養(yǎng)，標(biāo)記對照、1、2、3,搖床培養(yǎng)當(dāng)0。60柄0.6時加入4ulIPTG,而后對照、1、2、37^誘導(dǎo)4小時，3號試管15。。過夜誘導(dǎo)12h，離心收集菌體，取樣進(jìn)行SDS電泳分析。Cementprotein表達(dá)鑒定檢測圖1.1對照12 3M100kd75kd50kd32kd25kd15kd圖1.1Cementprotein64P-BA1蛋白表達(dá)鑒定Lane1：對照lane2：1號Lane3：2號lane4：3號Lane5：M如圖所示，根據(jù)專業(yè)軟件對蛋白基因序列分析此融合蛋白大小為58kd。對照組沒有58kd處無目的蛋白的表達(dá)，1號、2號為37°C、4h誘導(dǎo)有58kd處明顯表達(dá)條帶。3號為15°C、過夜誘導(dǎo)58kd處也有明顯表達(dá)條帶。

Cementprotein的可溶性分析取上述1號管3號管菌液400ul分別加入2支EP管中，離心去上清，沉淀用200ulTris重懸。冰水浴超聲破碎。離心，上清液取樣電泳，沉淀用200ulTris重懸，電泳。Cementprotein可溶性分析檢測圖3.21-上清1-沉淀3-上清3-沉淀M100kd1-上清1-沉淀3-上清3-沉淀M75kd50kd32kd25kd15kd圖1.2Cementprotein64P-BA1蛋白可溶性分析Lane1：對照lane2：1號Lane3：2號lane4：3號Lane5：M如圖所示，破碎離心上清和沉淀中58kd處都有明顯表達(dá)條帶，因?yàn)榈鞍自谏锨逯谢钚暂^高，這意味著蛋白正確折疊率高，易與和柱體結(jié)合，純化所得蛋白活性較高。而15°C、過夜誘導(dǎo)蛋白分泌速率相對較慢，蛋白易正確折疊，所以優(yōu)先采用15C、過夜誘導(dǎo)。這就是所謂的優(yōu)先做上清。

Cementprotein的分離純化本實(shí)驗(yàn)采用Ni-IDA親和層析一步純化蛋白Cementprotein ，最終得到的融合蛋白純度能達(dá)到90%以上，Cementprotein的分離純化檢測圖圖1.3Cementprotein圖1.3CementproteinLane1：全菌Lane3:流出Lane5：5064P-BA1蛋白純化檢測圖lane2：上清lane4：20Lane5：250如圖所示Lane1為全菌破碎后蛋白條帶58KD處有明顯表達(dá)條帶；Lane2為上清中蛋白條帶58KD處有明顯表達(dá)條帶；lane3為上清過柱后流出條帶；融合蛋白表達(dá)條帶降低很多，說明融合蛋白大量掛柱；Lane4為20mm咪唑洗滌后流出有雜質(zhì)和部分融合蛋白洗出；Lane5為50mm咪唑洗滌后流出有雜質(zhì)和部分融合蛋白洗出；Lane6為250mm咪唑洗脫后流出融合蛋白被大量洗脫，且濃度和純度很高。

Cementprotein的Westernblot檢測Cementprotein的Westernblot檢測圖圖1.4Cementprotein的Westernblot檢測圖Lanel：全菌 lane2:融合蛋白如圖Westernblot檢測58kd處有融合蛋白條帶，證明純化得到蛋白為實(shí)驗(yàn)預(yù)期純化的融合蛋白。5結(jié)論本實(shí)驗(yàn)利用Ni離子與咪唑基特異的親和性，使螯和有Ni離子的親和層析柱可以用來純化含有組氨酸的融合蛋白，在Cementprotein經(jīng)過重組后，融合蛋白帶上了HIS標(biāo)簽，在純化時可以特異性結(jié)合在層析柱上，用含高咪唑的ElutionBuffer溶液使蛋白Cementprotein與雜蛋白分開由電泳的檢測結(jié)果可知，用這種簡單、快捷的一步純化的方法,能夠得到達(dá)到電泳純的蛋白，而HIS標(biāo)簽并不影響蛋白Cementprotein的活性；重組后的蛋白Cementprotein雖然很穩(wěn)定，但在純化的過程當(dāng)中還要使蛋白溶液始終保持在低溫冰浴的環(huán)境中。接觸到蛋白的容器一定要滅菌干凈，避免雜菌的污染；在用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時先做一個濃度梯度，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)終濃度在1mM,溫度為37°C，時間為4h,融合蛋白產(chǎn)生量最多，但易形成包涵體。終濃度為0.5mM，溫度為15°C,時間為12h，上清中融合蛋白增多。參考文獻(xiàn)[4]趙永芳編著?！渡锘瘜W(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用（第二版）》。武漢大學(xué)出版社SvenLofdal,BengtGuss,MathiasUhlen,LennartPhilipson,andMartinLindberg.《geneforStreptococcalProteinG》.Proc,Natl,Acad,Sci,USA,Vol.80.pp697-701,February1983范代娣，沈立新，米玨編著?！吨亟M蛋白分離與分析》?；瘜W(xué)工業(yè)出版社，P2_P10（德）R.M.Kamp,（德）B.Wittmann-Liebold,（希臘）T.Choli-Papadopoulou?！兜鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)分析：制備，鑒定與微量測序》。北京科學(xué)出版社phyllis，nanodb，《蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)》葉勤主編。《現(xiàn)代生物技術(shù)原理及其應(yīng)用》。中國輕