PCR技術(包含引物設計)

〔PCR〕原理：原理：DNA聚合酶與啟動子的參與下，依據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在試驗條件下，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。DNA的變性和復性，并設計引物做啟DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復PCRDNA的自然復制過程，其特異性依靠于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR退火(復性〕延長三個根本反響步驟構成：DNA94℃左右確定時間PCRDNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反響作預備；DNA經加熱變性成單鏈DNA單鏈的互補序列配對結合；DNA-DNAdNTPDNA鏈互補的半保存復制鏈，重復循環(huán)就可獲得更多的“半保存復制鏈”，而且這種鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。技術分類〔常用〕PCR,IPCR)PCR是克隆序列旁側序列的一種方法．主要原理是用一種在序列中DNA的引物，擴增夾在中間的未知序列。該擴增產物是線性的DNA序列內部的酶切位點分布狀況。用不同的限制性內切酶消化，PCR獲得未知片PCR,APCR)：用酶法在一通用然后以此序列為cDNA進展擴增APCR。PCR)：兩種引物濃度比例PCR。在擴增循環(huán)中引入不同的引物濃度50～100÷110～15個循環(huán)中,高濃度引DNA。transcriptionPCRRT-PCR)：當RNA時cDNA才能進展擴增。應用格外廣泛無論是分子生物學還是臨床檢驗等都常常承受。增以提高模板量,然后再用一對內引物擴增以得到特異的PCR帶,此為巢式PCR。假設用一條外引物作內引物則稱之為半巢式PCR的操作步驟可將外引物設計得比內引物長些且用量較少PCR時承受較高的退火溫度而PCR時,由于較高退火溫度下內引物不能與模板結合故只有外引物擴增產物經過假設干次循環(huán)待外引物根本消耗盡PCR產物,PCR擴增。這不僅削減操作步驟,PCRPCR，DNA模板的擴增。PCR)：在同一反響中用多組引物同時擴增幾種基因片段,假設基因的某一區(qū)段有缺失,則相應的電泳譜上這一區(qū)帶就會消逝。主要用于同一病原體的分型及同時檢測多種病原體、多個點突變的分子病的診斷。PCRPCRPCR擴增體系中,5’-3’-端引物上帶上一段PCR擴增產物,經變性和復性,PCR產PCR條件下發(fā)生聚合延長反響,產生一個包含兩個不同基因的雜合基因。PCR技術：利用完整的細胞作為一個微小的反響體,在不破壞細胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內的擴增產物。直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進展ＰＣＲ擴增，可進展細胞內定位，適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列。PCR技術反響動力學反響動力學DNA擴增量呈指數(shù)上升，最Y=(1+X)n計算，YDNA片段擴增后的n表示循環(huán)次數(shù)。平均擴100%，但實際狀況達不到，反響初期靶序列產物的漸漸積存，被擴DNA聚合酶數(shù)量和活性、PCR擴增效率、非特異性產物的競爭等因素有關。擴增產物5’端之間，是需要擴增的特定片段。短、長產物片段是由于引物所結合的模板不同而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反響周期中，以兩條互補的35’端是固定的，內，形成長短全都的短產物片段。由于短產物片段是按指數(shù)倍數(shù)增加，而長產物片段則以算術倍數(shù)增加，故可無視不計，使DNA內，形成長短全都的短產物片段。由于短產物片段是按指數(shù)倍數(shù)增加，而長產物片段則以算術倍數(shù)增加，故可無視不計，使DNA片段供分析、監(jiān)測。DNAdNTP、Mg2+引物設計20bp左右。的片段。G+C40-60%為宜，G+C太少擴增效果不G+C過多易消滅非特異條帶。ATGC最好隨機分布，引物3個，一對引物間也不易多于四個Tm值應當協(xié)調：Tm=4〔G+C〕+2〔A+T〕】④避開引物內部消滅二級構造，避開兩條引物間互補，特別是3”端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。PCR延長的起始端，不能進展任3‘端也不能發(fā)生PCR擴增特異性影響不大，因此常用來引進修飾位點或標記物。適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。同源性。最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的時機。0.1～1umol10～100pmol最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的時機。TaqDNA聚合酶供給，一種是從棲熱水生桿菌中提純的自然酶，另一種為大腸菌合成的基因PCR0.5-2.5U/50ml，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量削減。的質量與濃度：dNTP溶液呈酸性，使用時應配成1MTris-HCLPH調整dNTPdNTP50～200umol/L，尤其是留意4dNTP的濃度要相等等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低PCR產物的產量。靶基因)PCR成SDS和K來消化處理標本。SDS的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDSK能水解DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核PCR反響。PCR擴增的特異性和產量有顯著的dNTP濃度為200umol/L為宜。Mg2+濃度過高，反TaqDNA聚合酶的活性，使反響產物削減。RT-PCR的反轉錄〔RT〕cDNA的聚合酶鏈式擴增〔PCR〕相結合的技術。RT-PCR法：1mlTrizol冰上抽打勻漿〔邊勻漿邊暫?！?min5min12023rpm，15min1.5mlEP管中，加等體10min12023rpm，10min〔4℃保存〕，振蕩混合7500rpm，5min20min(EP管倒置在濾紙上)RNA沉淀枯燥〔不能完全枯燥〕3-5min(或手握充分溶解〔-70℃〕RNA18s、28s條帶，分光光度吸光度比值DEPC水+5ulRNA〔150倍〕ug/ml=OD260×40×150ug/ml=OD260×6ug/ul之間260/280的比值看是不是28s、18s、5s的三條帶是不是清楚，一般質量好的RNA，28s:18s的亮度比例在2:1-20℃保存，長期-70℃保存〕反響體系：20ul體系一步：約20分鐘抽提物 引物 RNAsin 0.5μl6515分鐘2、馬上放入冰浴其次步：約2小時RNAsin 0.5μl10mMdNTP 緩沖液 4μl25mMMgCl2 AMV 3μl1.5小時5-10分鐘-20PCRPCR反響體系：100μl體系小時5小時25mMMgCl22μl3μl緩沖液5μl5μl10mMdNTP1μl1μl上游引物2.5μl2.5μl下游引物2.5μl2.5μl模板2.5μl5μlddH2O34μl30μl酶 0.5μl 1μl輕質石蠟油 50μl 50μl1分鐘，7221個循環(huán)秒，72130/40個循環(huán)7210分鐘4℃保存，5分鐘后-20℃保存或走電泳1.25小時300ml1.7%〔40ml0.5×TBE0.68g膠〕，微波2μl〔10mg/ml0.5μg/ml〕，充分混勻30-后現(xiàn)進展電泳反響產物+2μlDNAmarker5V/cm6、在紫外燈下觀看,DNA存在則顯示出紅色熒光條帶,承受凝膠)：Tris54g27.5g、0.5M1000ml5×TBE0.5×TBE就可以在電泳時使用(工作濃度)。(6×緩沖液，4℃保存)：0.25%溴酚藍、0.25%二30%甘油〔1.0%〕1.0g瓊脂糖+100ml電泳緩沖液，(假設首次煮膠，確定要煮透，以不消滅泡沫6010mg/ml溴化乙錠5μl，充分混勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的膠膜中，在4度冰箱加快瓊脂糖凝固)后現(xiàn)1.5g。試劑：DEPC1000ml容量瓶中加雙蒸水定1‰DEPC水，并充分振蕩混勻備用。乙醇：用無水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存。1.DEPC水的瓶子在蓋子40-45分鐘，所以水要適當多加一點；3.高壓完畢后，不要強行放氣，要讓壓力自然下降，不然水會噴出)。3、異丙醇：放入棕色瓶中。4、氯仿：放入棕色瓶中。5、輕質石蠟油RNA抽提試劑，可以直接從細胞或組織中胞并