DB35T 1995-2021禽心包積液-肝炎綜合征熒光定量 PCR 診斷技術(shù)

ICS11.220CCSB41□B35福建省地方標(biāo)準(zhǔn)DB35/T1995—2021禽心包積液-肝炎綜合征熒光定量PCR診斷

技術(shù)FluorescencequantitativePCRdiagnosisoffowlhydropercardium-hepatitis

syndrome2021-11-17實施2021-08-172021-11-17實施福建省市場監(jiān)督管理局 發(fā)布DB35/T1995DB35/T1995—2021#附錄A（規(guī)范性）

試劑的配制及引物序列A.1棉拭子稀釋液0.01mol/LPBS緩沖液中添加青霉素（10000IU/mL）、鏈霉素（10mg/mL）、慶大霉素（250pg/mL）和制霉菌素（5000IU/mL），調(diào)節(jié)pH至7.2?7.4。A.2組織稀釋液0.01mol/LPBS緩沖液中添加青霉素（2000IU/mL）、鏈霉素（2mg/mL）、慶大霉素（50pg/mL）和制霉菌素（1000IU/mL），調(diào)節(jié)pH至7.2?7.4。A.310%SDS溶液稱量10g十二烷基硫酸鈉，加入90mL滅菌雙蒸水，小心攪拌，緩慢加熱至水溫在25°C以上使之完全溶解。A.43mol/L的醋酸鈉緩沖溶液取800mL水加入408g三水醋酸鈉，溶解后用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2，加水定容到1000mL。A.575%乙醇量取750mL的無水乙醇加入250mL的滅菌雙蒸水。A.6熒光定量PCR檢測用引物序列熒光定量PCR檢測用引物序列為：a） 正向引物F*d\H4-F:5^CCCGATCTCAGTCAAATT-31；b） 反向引物FA^-4-R：，,'-TGCTAAACTTGTAACGGTC-3'；c） 探針引物FAdV-4^,：o,-F.4M-AACGACAAAAACACCGCC-MGB-3,o熒光定量PCR擴(kuò)增片段為196応，研物和探針用雙蒸水溶解至10gmol/L,保存于-20°C備用。66DB35/T1995—2021附錄B（資料性）熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖和擴(kuò)增產(chǎn)物參考基因序列B.1熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖以建立的熒光定量PCR診斷技術(shù)對2份陽性樣品和2份陰性樣品進(jìn)行檢測，同時設(shè)陽性對照和陰性對照，結(jié)果見圖B.1。標(biāo)引序號說明：-陽性對照；N—-陰性對照；陽性樣品；陽性樣品；-陰性樣品；-陰性樣品。圖B.1熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖B.2擴(kuò)增產(chǎn)物參考基因序列選擇FAdV-4GDMZ株（GenBank的登錄號：MG856954）Hexon基因序列作為參考基因序列：cccgatctcagtcaaattaaactctacaccaacaacaccgccgcgaacgacaaaaacaccgccgtggctaacgccactaccaacttctacttcggcacggtaccctcctacgaaatcgatatcagcgctac