現(xiàn)代生物技術(shù)課件 6組織工程

第七章

組織工程（TissueEngineering)一、概述

*組織工程(TissueEngineering)是近年來正在興起的一門新學(xué)科，屬于生物高技術(shù)范疇。標(biāo)志著醫(yī)學(xué)將走出犧牲健康組織為代價的“拆東墻補(bǔ)西墻”模式，步入制造組織器官的“再生醫(yī)學(xué)”新時代。

1.科幻與夢想

因疾病、創(chuàng)傷、事故、衰老和遺傳造成組織和器官的功能衰退、傷殘、缺陷乃至死亡是重大難題。人體的器官組織能象機(jī)器一樣，一旦出現(xiàn)問題，可以用“新的零件”更換。

人體配件庫、醫(yī)院、“修配廠”，

30年前提出：替換病損、功能不全的組織器官。器官移植、人造器官的興起(一)產(chǎn)生背景2.需求迫切：隨生活水平提高，對損傷、疾病治療要求越來越高，不僅要求治好傷、病，還要求良好功能及完美外形，應(yīng)用傳統(tǒng)的治療方法難以達(dá)到如此完善地步，需要尋找新的治療途徑。3.客觀可能：①科學(xué)技術(shù)總體水平提高，為患者、醫(yī)生對治療提出的高要求有實(shí)現(xiàn)可能，如細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和可控降解高分子材料問世，為體外構(gòu)建“組織”、“器官”提供條件。

②高、新技術(shù)的開發(fā)與利用是組織工程學(xué)研究的基礎(chǔ)，如基因工程技術(shù)、免疫隔離技術(shù)等為改造細(xì)胞提供了新方法。4.巨大市場需是組織工程學(xué)發(fā)展動力眾多的投資公司注入大量資本進(jìn)行組織工程學(xué)研究。這些是組織工程學(xué)研究發(fā)展的基礎(chǔ)與動力。5．80年代組織工程的誕生

①新材料、化工工程、電子技術(shù)、自動控制發(fā)展、生物醫(yī)學(xué)工程問世；1987年美國科學(xué)基金會在華盛頓舉行的生物工程小組會上首次提出TissueEngineering.

②

1988年正式定義為：應(yīng)用生命科學(xué)與工程學(xué)的原理與技術(shù)，在正確認(rèn)正常及病理兩種狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究開發(fā)用于修復(fù)、維護(hù)、促進(jìn)人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物的一門新興學(xué)科。6.90年代組織工程的發(fā)展

細(xì)胞工程，組織類型培養(yǎng)技術(shù)普及，多學(xué)科交叉形成新興邊緣學(xué)科，組織工程只有十年的歷史。組織工程學(xué)研究10多年時間里，已取得了十分可喜成績。

《組織工程學(xué)》（Skalak等著）的出版，標(biāo)志著組織工程跨入了系統(tǒng)的學(xué)科性研究范疇。第一個組織工程產(chǎn)品人工皮膚已于1997年3月經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市。這種產(chǎn)品是器官基因公司培養(yǎng)出的，被稱為"適移植"的活性皮膚，它由新生兒的包皮細(xì)胞培植而成，呈層狀結(jié)構(gòu)，與正常人的皮膚極為相似，能分泌人體皮膚膠原、生長因子和結(jié)構(gòu)性蛋白，可與病人自身的皮膚很好地融合，不存在排異作用。

2000年3月10日，AdvancedTissueSciences公司宣布將在公布促進(jìn)心肌血管形成的產(chǎn)品臨床前實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。該產(chǎn)品應(yīng)用后14天即開始形成新的血管。

二、組織工程概念和分類

1．定義：

運(yùn)用工程學(xué)和生命科學(xué)原理和方法，在了解正常和病理學(xué)組織結(jié)構(gòu)－功能關(guān)系和生長機(jī)理的基礎(chǔ)上，去研制生物學(xué)的組織器官替代物，通過移植達(dá)到恢復(fù)、重建、維持和改進(jìn)組

織功能的學(xué)科。

組織工程是應(yīng)用現(xiàn)代生命科學(xué)、材料科學(xué)、計算機(jī)科學(xué)和工程學(xué)等學(xué)科的原理與方法，用于替代、修復(fù)、改善或再造人體各種組織器官損傷科學(xué)。這一新的交叉領(lǐng)域也稱組織器官工程。

2．分類

(1)傳統(tǒng)組織工程

運(yùn)用異種、同種、異體、自體組織和人工合成材料，通過工程技術(shù)形成與人體組織相同或類似器官，然后移植人體替代、修補(bǔ)、恢復(fù)人體某一組織器官功能。

(2)現(xiàn)代組織工程

以干細(xì)胞工程為代表的組織工程，包括ES、成體干細(xì)胞→體外培養(yǎng)→增殖→定向誘導(dǎo)分化→細(xì)胞三維培養(yǎng)

（胞外基質(zhì)支架＋間質(zhì)細(xì)胞）→特定的、具有新功能的組織器官類似物。

(3)按移植物作用模式分類

組織工程的最終目標(biāo)是通過體外培養(yǎng)細(xì)胞與外環(huán)境作用發(fā)育成有生物活性替代物，經(jīng)移植達(dá)到替換、修復(fù)組織或強(qiáng)化

其功能（細(xì)胞→組織→器官）。

組織工程移植類型和作用模式

類型移植物作用模式舉例物理型生物機(jī)械性功能血管、軟骨、韌帶生理型生理性功能肝、腎化學(xué)型細(xì)胞產(chǎn)生可胰島、神經(jīng)、溶性成份結(jié)合型具有多種功能皮膚、耳朵、乳房3.組織工程的基本三要素：*細(xì)胞(Cell)

－增殖、分化、自組裝成組織和器官**生長因子(Growthfactor)

－調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化***胞外基質(zhì)（Extracellularmatrix,ECM)

－支撐和指導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化組織工程圖示細(xì)胞生長因子多孔性鷹架(生醫(yī)材料)體外長成組織或器官之後再植入病人缺損部位

A、細(xì)胞

細(xì)胞必須能不斷進(jìn)行細(xì)胞分裂，且必須能

被調(diào)控分化成特定的組織細(xì)胞

干細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞

組織來源細(xì)胞

自體或異體Growthfactorstimulation全能細(xì)胞B、組織生長支架需求：

（1）生物親和性

（2）生物可降解性

（3）三維內(nèi)部連通孔隙

（4）具備支架強(qiáng)度。蛋白質(zhì)支架

多糖支架

磷酸鈣基生物材料

硫酸鈣基生物材料

C、生長因子

表皮生長因子：

是對上皮細(xì)胞增殖有很強(qiáng)促進(jìn)作用的

53個氨基酸殘基的多肽。

神經(jīng)生長因子：

為神經(jīng)細(xì)胞特異性分泌的營養(yǎng)蛋白。

肝細(xì)胞生長因子：

為728個氨基酸殘基單鏈組成。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白：

能誘導(dǎo)或刺激新骨的生成。

4.

基本原理和方法

體外培養(yǎng)擴(kuò)增的正常組織細(xì)胞吸附于一種具有優(yōu)良細(xì)胞相容性并可被機(jī)體降解吸收的生物材料上形成復(fù)合物，然后將細(xì)胞——生物材料復(fù)合物植入人體組織、器官的病損部位，在作為細(xì)胞生長支架的生物材料逐漸被機(jī)體降解吸收的同時，細(xì)胞不斷增殖、分化，形成新的并且其形態(tài)、功能方面與相應(yīng)組織、器官一致的組織，從而達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。核心問題建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體

三、組織工程研究主要

內(nèi)容與基本方法

1．對靶組織正常和病理學(xué)的研究，

特別是結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

2．體外設(shè)計方案，即通過培養(yǎng)人體

組織，通過移植術(shù)達(dá)到替代修復(fù)病

變組織的目的。

3．種子細(xì)胞的選擇、培養(yǎng)及其性質(zhì)

的研究和應(yīng)用。4．細(xì)胞外基質(zhì)、生物材料

支架的開發(fā)及性質(zhì)研究。

5．體外構(gòu)建含功能細(xì)胞/不含功

能細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)替代物用

于植入機(jī)體。

6．植入機(jī)體后，起到替代病變

組織或器官的目的。研究路線1)將體外培養(yǎng)的高濃度組織細(xì)胞，擴(kuò)增后吸附于一種生物相容性良好、并可被人體逐步降解吸收的細(xì)胞外基質(zhì)上。2)該材料可為細(xì)胞提供生存的三維空間，有利于細(xì)胞獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行氣體交換，使細(xì)胞按預(yù)制形態(tài)的三維支架生長。3)將這種細(xì)胞生物材料復(fù)合體植入機(jī)體病損部位，在生物支架降解吸收過程中，種植的細(xì)胞繼續(xù)增生繁殖，形成了新的具有其原來特殊功能和形態(tài)的相應(yīng)組織和器官，達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。4）將構(gòu)建物移植機(jī)體的方法。皮膚修復(fù)骨修復(fù)

組織工程產(chǎn)品的一般步驟

靶組織/器官結(jié)構(gòu)－功能，生理－病理胞外基質(zhì)生物材料方案設(shè)計選擇分離細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞外基質(zhì)，支架接種三維培養(yǎng)成型替代物（結(jié)構(gòu)、生物活性）培養(yǎng)體外輔助裝置培養(yǎng)人工肝、腎、心移植人體開放

(皮膚、軟骨）封閉(半透膜隔離免疫細(xì)胞)

(二)舉例

1．人工肝臟－肝臟組織工程：

肝組織中有八種肝臟細(xì)胞，主要是

肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、六種種子細(xì)胞

才形成肝小葉。

①培育肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞

將50億個肝細(xì)胞膜外邊包上粘性蛋白

后，置于淀粉珠上。

②用多聚乙醇酸微絲制成一個精細(xì)軟管

網(wǎng)絡(luò)。③把帶有肝細(xì)胞淀粉珠撒布在網(wǎng)狀支架，制成“人工肝”，培養(yǎng)。④將人工肝放在無菌環(huán)境中，肝病患者血液從中流過。結(jié)果：

排除血液中有毒物＋釋放酶和激素功能接近正常肝目標(biāo)：

植入肝功衰竭體內(nèi)，代替肝臟功能并分泌膽汁。①可吸收材料＋皮膚成體干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和增殖→材料吸收→成型皮膚。②皮膚生物反應(yīng)器透明塑料薄膜＋表皮細(xì)胞→培養(yǎng)0.4米2皮膚，用于治療燒傷、皮膚病、美容。

第一個組織工程產(chǎn)品人工皮膚已于1997年3月經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市2.人造皮膚－皮膚組織工程

3．人工心臟瓣膜

*

過去分類①機(jī)械：壽命10－20年，終身抗凝治療；②生物：壽命5－8年，一生2－3次人工換膜。

*現(xiàn)在分類新型可降解材料心瓣膜外型－腔內(nèi)植入心肌細(xì)胞→培養(yǎng)后植入體（6周）→生物降解材料自動分解→與天然類似瓣膜、無排異、受用終身。

4．人造血管－血管組織工程

現(xiàn)在多用高分子材料，直徑4mm以下易栓塞。

日本用3mm硅棒，插入超微聚脂纖維細(xì)管內(nèi)腔，植入人體皮下三周，纖維芽細(xì)胞進(jìn)入聚脂纖維間隙形成織管，拔出硅棒形成血管。

5．人造軟骨－軟骨組織工程

多聚乙醇酸微絲網(wǎng)織物→培養(yǎng)液器皿中加入人軟骨細(xì)胞（數(shù)周）→軟骨細(xì)胞增殖填滿全部空間（網(wǎng)織物分解H2O＋CO2）→形成大小同網(wǎng)織物的軟骨制品。

1995年曹誼林采用類似技術(shù)種植于小鼠，在小鼠背上長出人型耳朵。人耳支架－牛軟骨細(xì)胞采集、培養(yǎng)繁殖→接種支架培養(yǎng)一周→移植裸鼠皮下，6周后人耳模型成功。實(shí)驗(yàn)中的組織工程耳

軟骨組織工程是組織工程突破口，其原因主要是：

①軟骨再生、自修能力極其有限，大于4mm直徑不能修復(fù)。

②軟骨組織細(xì)胞極為單一、易成功、易獲得、易培養(yǎng)。

③應(yīng)用廣，特別在美容和矯形。目前已成功研制耳、鼻、氣管、關(guān)節(jié)軟骨，此外對骨、肌腱的研究也相當(dāng)成功。

四、組織工程中的

關(guān)鍵技術(shù)

組織構(gòu)成細(xì)胞的培養(yǎng)生物組織是由實(shí)質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成。對于組織工程來說，首先要求獲取所要培養(yǎng)組織的細(xì)胞。細(xì)胞可來源于自體細(xì)胞，這是一種較常規(guī)的選擇，可以避免機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，但是受到種類、數(shù)量、時間等限制。因此必須考慮其它方式來獲取細(xì)胞，如應(yīng)用治療性克隆技術(shù)從胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成組織特異干細(xì)胞或應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得工程細(xì)胞。獲取細(xì)胞后，還要研究細(xì)胞擴(kuò)增防老化技術(shù)及其機(jī)理，干細(xì)胞快速、規(guī)模擴(kuò)增等問題。

(一)種子細(xì)胞

1．傳統(tǒng)組織工程種子細(xì)胞

除骨髓細(xì)胞外，多需體外擴(kuò)增到一定量才能應(yīng)用。目前能在體外大量擴(kuò)增的細(xì)胞有：角質(zhì)細(xì)胞、成纖維、軟骨及成肌細(xì)胞。而正常肝、神經(jīng)細(xì)胞則難于擴(kuò)增，應(yīng)用受限。細(xì)胞來源取決于功能要求、能否增殖及經(jīng)濟(jì)因素，目前常用來源：

(1)自體細(xì)胞

自體組織→分離細(xì)胞→培養(yǎng)增

殖→移植自體

如：皮膚→角質(zhì)細(xì)胞→擴(kuò)增

2000倍→細(xì)胞層移植

(2)募集自體細(xì)胞

提供胞外基質(zhì)材料組成（如天然膠原）的無細(xì)胞支架，植入機(jī)體促使細(xì)胞浸潤，常在支架中加入某些細(xì)胞化學(xué)因子，指導(dǎo)細(xì)胞趨化，增殖和分化，形成有功能的活體組織。如無細(xì)胞、血管，也可用于骨骼、真皮、韌帶修復(fù)。

(3)同種異體

常用原代細(xì)胞，是常見的一種移植類型。新鮮分離異體原代細(xì)胞（配型）→體外擴(kuò)增/不擴(kuò)增→工程組織→移植，此種細(xì)胞可利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行改造，或加入細(xì)胞因子使之分化并克服宿主免疫反應(yīng)。目前有人用轉(zhuǎn)化細(xì)胞作，應(yīng)注意致瘤性，可使用微囊包埋法、或體外應(yīng)用。細(xì)胞應(yīng)嚴(yán)格查HIV、HBV和HCV。

(4)異種細(xì)胞

異種細(xì)胞移植有強(qiáng)烈免疫排斥反應(yīng)，還要考慮細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能及分泌物的兼容性，以及微生物跨種屬傳播可能性。細(xì)胞微囊化技術(shù)、基因改造技術(shù)也可應(yīng)用。如將豬胰島細(xì)胞微囊包埋，經(jīng)免疫隔離后移植，代替人胰島細(xì)胞。

2．現(xiàn)代種子細(xì)胞－干細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞，成體干細(xì)胞）

(1)基本條件

現(xiàn)代種子細(xì)胞較傳統(tǒng)的自體、同種、異種細(xì)胞具有以下優(yōu)越性，滿足了種子細(xì)胞四個基本條件：①具有特定分化潛能或定向分化表型；②體外增殖但無致瘤性；③細(xì)胞來源可靠；④不引發(fā)移植排異反應(yīng)。

(2)干細(xì)胞分離培養(yǎng)、

增殖和分化（略）。

仍需進(jìn)一步解決：

①分離、增殖技術(shù)；②定向分化機(jī)制與技術(shù)。

(3)移植安全性。

3．種子細(xì)胞的三維培養(yǎng)技術(shù)

——組織工程的突破口。

細(xì)胞的三維培養(yǎng)（細(xì)胞分化機(jī)理、材料學(xué)發(fā)展）

種子細(xì)胞→功能細(xì)胞（實(shí)質(zhì)細(xì)胞）特定三維結(jié)構(gòu)可吸收降解材料→基質(zhì)支架+間質(zhì)細(xì)胞

生物材料及構(gòu)架制備

為了形成具有三維結(jié)構(gòu)的組織，必須提供一個構(gòu)架，構(gòu)架選擇的聚合體必須有足夠的彈性提供細(xì)胞一個類似生命體的力學(xué)環(huán)境，充分多的孔隙允許培養(yǎng)液浸潤生長的組織，傳輸營養(yǎng)物質(zhì)和清除細(xì)胞代謝廢物，隨著組織的生長能夠自我降解，但是降解速度不能太快，要有足夠的時間保證細(xì)胞長進(jìn)去，及時填補(bǔ)聚合體溶解留下的空隙。（二）細(xì)胞外基質(zhì)

（extracelluarmatrix,ECM）

組織是由形態(tài)相似，功能相關(guān)的細(xì)胞、細(xì)胞間質(zhì)組成。細(xì)胞間質(zhì)包括均質(zhì)狀態(tài)的基質(zhì)（蛋白多糖、糖蛋白）和細(xì)絲狀的膠原纖維。ECM是細(xì)胞附著的基本框架和代謝場所，其形態(tài)和功能直接影響所構(gòu)成的組織形態(tài)和功能。

組織工程細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）材料

組織工程也要求細(xì)胞外基質(zhì)具有種子細(xì)胞附著框架，并能在其中代謝生長、分化。因此，細(xì)胞外基質(zhì)的形態(tài)和功能直接影響替代物組織的形態(tài)和功能。

三維培養(yǎng)是組織工程關(guān)鍵技術(shù)，其功用

①為細(xì)胞提供與組織來源相似生長環(huán)境和細(xì)胞聯(lián)系。

②利于定向誘導(dǎo)，表型維持和細(xì)胞增殖。

③利于體外構(gòu)建與各類細(xì)胞三維生長類似物，工程學(xué)關(guān)鍵。

④神經(jīng)和血管形成是大問題。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分膠原蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖、層連蛋白和彈性蛋白等作用 影響細(xì)胞形態(tài) 促進(jìn)細(xì)胞遷移 調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化組織工程支架的要求符合生物安全性要求合適的可生物降解吸收性合適的孔尺寸、高孔隙率和相連的孔形態(tài)特定的三維外形高表面積和合適的表面理化性質(zhì)與植入部位組織力學(xué)性能相匹配的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度基本概念支架設(shè)計及制備技術(shù)支架材料天然高分子材料合成降解聚合物生物陶瓷生物復(fù)合材料

1．細(xì)胞外基質(zhì)（ExtracellularMatrix，

ECM）材料要求

開發(fā)生物相容性材料是組織工程的核心技術(shù)之一，其要求是：

①具有高生物可降解性；②具有好的生物相容性，指材料惰性，不因理化、生物性質(zhì)變化引起不良反應(yīng)。但也包括材料活性，即可指導(dǎo)、激發(fā)正常細(xì)胞生長、粘附、分化；③不引發(fā)機(jī)體免疫排斥反應(yīng)。

2．作用與不良反應(yīng)

組織工程