典型乳糖操縱子的誘導原理

典型乳糖操縱子的誘導原理當前第1頁\共有33頁\編于星期三\0點中心法則(thecentraldogma)基因表達(geneexpression)--基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的過程。產(chǎn)生各種RNA(tRNA、mRNA、rRNA)和各種蛋白質(zhì)多肽鏈。RNA(tRNA、mRNA和rRNA當前第2頁\共有33頁\編于星期三\0點

基因的表達方式

根據(jù)生物對內(nèi)外環(huán)境刺激的反應(yīng)，將基因表達的方式分為：

組成型表達誘導和阻遏表達相關(guān)定義當前第3頁\共有33頁\編于星期三\0點組成型表達（constitutive

gene

expression）

在個體發(fā)育的任一階段都能在大多數(shù)細胞中持續(xù)進行的基因表達，無論表達的水平高或低，它受環(huán)境因素的影響較少、或變化很小。且基因表達產(chǎn)物通常是對生命過程必需的、必不可少的，這類基因通常被稱為持家基因（housekeeping

gene）。相關(guān)定義當前第4頁\共有33頁\編于星期三\0點誘導和阻遏表達誘導（induction）：在特定的環(huán)境信號刺激下，相應(yīng)基因被激活，從而使基因的表達產(chǎn)物增加。這類基因稱為可誘導基因?？烧T導基因在特定環(huán)境中表達增強的過程，稱為誘導

(induction)。乳糖→利用乳糖的三種酶表達阻遏（repression）：在特定環(huán)境信號刺激下，相應(yīng)基因被抑制，從而使基因的表達產(chǎn)物減少。這類基因稱為可阻遏基因?？勺瓒艋虮磉_產(chǎn)物水平降低的過程稱為阻遏(repression）。

相關(guān)定義當前第5頁\共有33頁\編于星期三\0點協(xié)調(diào)表達

(coordinateexpression)

在一定機制控制下，功能上相關(guān)的一組基因，無論其為何種表達方式，均需協(xié)調(diào)一致、共同表達，使各表達產(chǎn)物的分子比例適當，從而正常發(fā)揮功能。這種現(xiàn)象稱為協(xié)調(diào)表達(coordinateexpression)，這種調(diào)節(jié)稱為協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)(coordinateregulation)。相關(guān)定義當前第6頁\共有33頁\編于星期三\0點乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)和功能操縱子模型的提出

1960-1961年，莫洛(Monod)和雅各布(Jacob)首次提出“操縱子”學說。

獲1965年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎1940年，Monod發(fā)現(xiàn)：細菌在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長時，細菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源轉(zhuǎn)變期，細菌的生長會出現(xiàn)停頓。即產(chǎn)生“二次生長曲線”。操縱子（operon)：很多功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)排列在染色體上，由一個共同的控制區(qū)來操縱這些基因的表達，包含這些結(jié)構(gòu)基因和控制區(qū)的整個核苷酸序列就稱為操縱子。

當前第7頁\共有33頁\編于星期三\0點操縱子的組成：----結(jié)構(gòu)基因(structuralgene,SG)：操縱元中被調(diào)控的編碼蛋白質(zhì)的基因----啟動子(promoter，P)：是指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。----操縱基因(operator，O)：是指能被調(diào)控蛋白特異性結(jié)合的一段DNA序列。阻遏物基因(inhibitor,I),產(chǎn)生阻遏物(repressor)。乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)和功能當前第8頁\共有33頁\編于星期三\0點三個特異性序列：操縱序列O(operator):阻遏蛋白結(jié)合位點。啟動子P(promoter):位于結(jié)構(gòu)基因的上游。CAP結(jié)合位點：環(huán)cAMP受體蛋白(分解代謝物激活蛋白)結(jié)合位點。一個調(diào)節(jié)基因lacI：編碼阻遏蛋白，能結(jié)合于操縱序列位點。乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)和功能當前第9頁\共有33頁\編于星期三\0點結(jié)構(gòu)基因Z編碼β-半乳糖苷酶：將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。Y編碼β-半乳糖苷透過酶：使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透過大腸桿菌細胞壁和原生質(zhì)膜進入細胞內(nèi)。A編碼β-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶：乙酰輔酶A上的乙酰基轉(zhuǎn)到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)和功能當前第10頁\共有33頁\編于星期三\0點當一個mRNA含有編碼一個以上蛋白質(zhì)的編碼信息，而且這些蛋白質(zhì)都是以獨立的多肽被翻譯時，這樣的mRNA稱之多順反子mRNA。多順反子mRNA在細菌中是很普遍的。多順反子lacmRNA中的lacZ，lacY，lacA經(jīng)翻譯生成的產(chǎn)物分別生成代謝分解乳糖的三種酶始終存在著一定的比例關(guān)系(Z:Y:A=5:2:1)乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)和功能當前第11頁\共有33頁\編于星期三\0點乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)和功能當前第12頁\共有33頁\編于星期三\0點lacZ、Y、A基因的轉(zhuǎn)錄是由lacI基因指令合成的阻遏蛋白R所控制。lacI一般和結(jié)構(gòu)基因相毗連，但它本身具有自己的啟動子和終止子，成為獨立的轉(zhuǎn)錄單位。由于lacI的產(chǎn)物是可溶性蛋白，按照理說是無需位于結(jié)構(gòu)基因的附近。它是能夠分散到各處或結(jié)合到分散的DNA位點上。乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)和功能當前第13頁\共有33頁\編于星期三\0點阻遏蛋白的負調(diào)控

(negativecontrolofrepressor)阻遏蛋白的負調(diào)節(jié)(negativecontrolofrepressor)無乳糖(nolactose):

lac操縱元處于阻遏狀態(tài)(repression)有乳糖(presenceoflactose)：lac操縱元即可被誘導(derepression,induction)誘導劑(inducer):別乳糖、半乳糖、IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）當前第14頁\共有33頁\編于星期三\0點TheLacOperon:

WhenGlucoseIsPresentButNotLactoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRNAPol.RepressorRepressorRepressormRNAHeyman,I’mconstitutiveComeon,letmethroughNoway!CAP當前第15頁\共有33頁\編于星期三\0點TheLacOperon:

WhenLactoseIsPresentButNotGlucoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressormRNAHeyman,I’mconstitutiveLacRepressorRepressorXThislactosehasbentmeoutofshapeYeah…!RNAPol.RNAPol.當前第16頁\共有33頁\編于星期三\0點

乳糖操縱子的調(diào)控機理當前第17頁\共有33頁\編于星期三\0點乳糖操縱子誘導物別乳糖(allolactose)是誘導物當前第18頁\共有33頁\編于星期三\0點為什么選用IPTG作誘導物？能誘導酶的合成，但又不被分解的分子,稱為安慰誘導物（gratuitousinducer）。由于乳糖雖可誘導酶的合成，但又隨之分解，產(chǎn)生很多復雜的動力學問題，因此人們常用安慰誘導物來進行各種實驗。X-gal（5-溴-4-錄-3-吲哚-β-半乳糖苷）也是一種人工化學合成的半乳糖苷，可被β－半乳糖苷酶水解產(chǎn)生蘭色化合物，因此可以用作β－半乳糖苷酶活性的指示劑。IPTG和X-gal都被廣泛應(yīng)用在分子生物學和基因工程的工作中。

當前第19頁\共有33頁\編于星期三\0點為什么選用IPTG作誘導物？某些誘導物與自然的β-半乳糖苷酶相似，且不能被酶分解，比如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，（isopropylthiogalactoside,IPTG）。不被細菌分解性質(zhì)穩(wěn)定，它的濃度在實驗中不會改變。復雜的動力學問題，便于研究。IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被運送。當前第20頁\共有33頁\編于星期三\0點為什么選用IPTG作誘導物？乳糖（葡萄糖-β-1，4-D-半乳糖苷）

半乳糖苷鍵中用硫代替了氧，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物與酶位點的親和力相同，IPTG雖不為β-半乳糖苷酶所識別，但它是lac基因簇十分有效的誘導物。當前第21頁\共有33頁\編于星期三\0點乳糖操縱子的CAP正調(diào)控

（PositiveControlofCAP）CAP(cataboliteactivatorprotein)----分解代謝基因激活蛋白

又稱為CRP(cAMPreceptorprotein),lacoperon高水平轉(zhuǎn)錄必需的一個激活蛋白。CAP(同二聚體),含

DNA結(jié)合區(qū)→以二聚體的方式與特定的DNA序列結(jié)合

cAMP結(jié)合區(qū)→與cAMP特異結(jié)合，并發(fā)生空間構(gòu)象的變化,形成cAMP-CAP復合物（有活性）當前第22頁\共有33頁\編于星期三\0點乳糖操縱子的CAP正調(diào)控

（PositiveControlofCAP）

當CAP與CAP結(jié)合位點這段序列結(jié)合時，可激活RNA轉(zhuǎn)錄酶活性，使之提高50X葡萄糖→→→→→降解產(chǎn)物ATP→→cAMP→→5’AMPCRP（非活性狀態(tài)）→→CAP（活性狀態(tài)）當前第23頁\共有33頁\編于星期三\0點乳糖操縱子的CAP正調(diào)控

（PositiveControlofCAP）++++轉(zhuǎn)錄無葡萄糖，cAMP濃度高時促進轉(zhuǎn)錄有葡萄糖，cAMP濃度低時不促進轉(zhuǎn)錄CAPZYAOPDNACAPCAPCAPCAPCAP當前第24頁\共有33頁\編于星期三\0點乳糖操縱子的CAP正調(diào)控

（PositiveControlofCAP）葡萄糖效應(yīng)：當細菌在含有葡萄糖套和乳糖的培養(yǎng)基中生長時，通常優(yōu)先利用葡萄糖。只有當葡萄糖消耗完，經(jīng)過一段停滯期，在乳糖的誘導下半乳糖苷酶開始合成，細菌才能充分利用乳糖。葡萄糖的降解物能抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，并活化磷酸二脂酶，因而降低cAMP的濃度。所以葡萄糖存在時，cAMP濃度低；僅在葡萄糖消耗完畢時,cAMP濃度增高，CAP-cAMP復合物形成（結(jié)合于lacoperonCAP結(jié)合位點)，才會促進轉(zhuǎn)錄。當前第25頁\共有33頁\編于星期三\0點乳糖操縱子的協(xié)調(diào)調(diào)控

(coordinateregulation)由于Plac是弱啟動子，單純因乳糖的存在發(fā)生去阻遏使lac操縱元轉(zhuǎn)錄開放，還不能使細菌很好利用乳糖，必需同時有CAP來加強轉(zhuǎn)錄活性，細菌才能合成足夠的酶來利用乳糖。關(guān)鍵條件：lac操縱元的強誘導既需要有乳糖的存在又需要沒有葡萄糖可供利用。當前第26頁\共有33頁\編于星期三\0點Lac操縱子基因表達受阻遏蛋白和CAP的雙重調(diào)控當前第27頁\共有33頁\編于星期三\0點TheLacOperon:

WhenLactoseIsPresentButNotGlucoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressormRNAHeyman,I’mconstitutiveCAPcAMPLacRepressorRepressorXThislactosehasbentmeoutofshapeCAPcAMPCAPcAMPBindtomePolymeraseYeah…!RNAPol.RNAPol.當前第28頁\共有33頁\編于星期三\0點TheLacOperon:

WhenNeitherLactoseNorGlucoseIsPresentRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingCAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPBindtomePolymeraseRNAPol.RepressorRepressormRNAHeyman,I’mconstitutiveRepressorSTOPRightthere