分子遺傳轉(zhuǎn)錄翻譯一

中心法則兩種模板，三種產(chǎn)物當(dāng)前第1頁\共有141頁\編于星期三\0點1、原核生物的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控2、真核生物的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控3、原核生物的翻譯及翻譯調(diào)控4、真核生物的翻譯及翻譯調(diào)控當(dāng)前第2頁\共有141頁\編于星期三\0點1、原核生物的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控RNA聚合酶啟動子轉(zhuǎn)錄過程轉(zhuǎn)錄調(diào)控當(dāng)前第3頁\共有141頁\編于星期三\0點RNA合成與DNA合成異同點

相同點都以DNA鏈作為模板合成的方向均為5’→3’聚合反應(yīng)均是通過核苷酸之間形成的3’,5’-磷酸二酯鍵，使核苷酸鏈延長當(dāng)前第4頁\共有141頁\編于星期三\0點不同點復(fù)制轉(zhuǎn)錄模板兩條鏈均復(fù)制模板鏈轉(zhuǎn)錄（不對稱轉(zhuǎn)錄）原料dNTPNTP酶DNA聚合酶RNA聚合酶產(chǎn)物子代雙鏈DNA（半保留復(fù)制）mRNA，tRNA，rRNA配對A-T；G-CA-U；T-A；G-C引物RNA引物無當(dāng)前第5頁\共有141頁\編于星期三\0點RNA聚合酶與DNA聚合酶的區(qū)別RNA聚合酶DNA聚合酶大小(M)大，4.8×105dol小，1.09×105dol引物無有產(chǎn)物較短，游離較長，與模板以氫鍵相連作用方式一條鏈的某一段兩條鏈同時進行外切酶活性無5’3’，3’5’校對合成能力無有修復(fù)能力無有當(dāng)前第6頁\共有141頁\編于星期三\0點大腸桿菌RNA聚合酶的組成結(jié)合底物，催化磷酸二酯鍵形成堿性基團與DNA的靜電作用，結(jié)合DNA識別特定的啟動子全酶重建－亞基之間的作用當(dāng)前第7頁\共有141頁\編于星期三\0點大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識別的啟動子區(qū)T85T83G81A61C69A52T89A89T50A65A100當(dāng)前第8頁\共有141頁\編于星期三\0點RNA聚合酶保護法當(dāng)前第9頁\共有141頁\編于星期三\0點轉(zhuǎn)錄的基本過程當(dāng)前第10頁\共有141頁\編于星期三\0點轉(zhuǎn)錄終止終止子（terminator）強終止子－內(nèi)部終止子弱終止子－需要ρ因子（rhofactor）又稱為ρ依賴性終止子（Rho-dependentterminator）不依賴Rho(ρ)因子的轉(zhuǎn)錄終止依賴Rho(ρ)因子的轉(zhuǎn)錄終止當(dāng)前第11頁\共有141頁\編于星期三\0點強終止子:不依賴因子的終止發(fā)夾式結(jié)構(gòu)和寡聚U的共同作用使RNA從三元復(fù)合物中解離出來。聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓當(dāng)前第12頁\共有141頁\編于星期三\0點終止效率與二重對稱序列和寡聚U的長短有關(guān)，長度效率當(dāng)前第13頁\共有141頁\編于星期三\0點依賴因子的終止因子：六聚體蛋白、水解各種核甘三磷酸促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。當(dāng)前第14頁\共有141頁\編于星期三\0點轉(zhuǎn)錄后加工當(dāng)前第15頁\共有141頁\編于星期三\0點對于原核生物，以營養(yǎng)狀況和環(huán)境因素為主要的基因表達影響因素。原核生物的基因調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，根據(jù)調(diào)控機制的不同可分為負轉(zhuǎn)錄調(diào)控和正轉(zhuǎn)錄調(diào)控在轉(zhuǎn)錄水平上對基因表達調(diào)控取決于DNA的結(jié)構(gòu)、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。轉(zhuǎn)錄調(diào)控當(dāng)前第16頁\共有141頁\編于星期三\0點1、操縱子模型的提出1961年，Monod和Jacob提出獲1965年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎操縱子學(xué)說FrancisJacob

JacquesMonod

當(dāng)前第17頁\共有141頁\編于星期三\0點1940年，Monod發(fā)現(xiàn)：細菌在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長時，細菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源轉(zhuǎn)變期，細菌的生長會出現(xiàn)停頓。即產(chǎn)生“二次生長曲線”。1947年，報告：“酶的適應(yīng)現(xiàn)象及其在細胞分化中的意義”當(dāng)前第18頁\共有141頁\編于星期三\0點1951年，Monod與Jacob合作，發(fā)現(xiàn)兩對基因：Z基因：與合成β-半乳糖苷酶有關(guān)；I基因：決定細胞對誘導(dǎo)物的反應(yīng)。Szilard：I基因決定阻遏物的合成，當(dāng)阻遏物存在時，酶無法合成，只有有誘導(dǎo)物存在，才能去掉該阻遏物。Jacob：結(jié)構(gòu)基因旁有開關(guān)基因（操縱基因），阻遏物通過與開關(guān)基因的結(jié)合，控制結(jié)構(gòu)基因的表達。當(dāng)前第19頁\共有141頁\編于星期三\0點2、操縱子的定義操縱子：是基因表達的協(xié)調(diào)單位，由啟動子、操縱基因及其所控制的一組功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因所組成。操縱基因受調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的控制。當(dāng)前第20頁\共有141頁\編于星期三\0點操縱元是一種完整的具有特定功能的細菌基因表達和調(diào)節(jié)的單位，包括調(diào)節(jié)基因，操縱位點，結(jié)構(gòu)基因，組成一個控制單元。結(jié)構(gòu)基因：產(chǎn)生mRNA,合成蛋白質(zhì)。操縱位點：調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點。調(diào)節(jié)基因：產(chǎn)生調(diào)節(jié)蛋白（與操縱位點結(jié)合）→結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物存在時，可與阻遏蛋白結(jié)合→結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄當(dāng)前第21頁\共有141頁\編于星期三\0點

1、根據(jù)操縱子對調(diào)節(jié)蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白）的應(yīng)答，可分為：正轉(zhuǎn)錄調(diào)控負轉(zhuǎn)錄調(diào)控

原核基因調(diào)控機制的類型與特點當(dāng)前第22頁\共有141頁\編于星期三\0點調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因阻遏蛋白激活蛋白正轉(zhuǎn)錄調(diào)控負轉(zhuǎn)錄調(diào)控正轉(zhuǎn)錄調(diào)控如果在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時基因是關(guān)閉的，加入這種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因活性就被開啟，這樣的調(diào)控稱正轉(zhuǎn)錄調(diào)控。當(dāng)前第23頁\共有141頁\編于星期三\0點調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因阻遏蛋白激活蛋白正轉(zhuǎn)錄調(diào)控負轉(zhuǎn)錄調(diào)控負轉(zhuǎn)錄調(diào)控在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時基因是表達的，加入這種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因表達活性便被關(guān)閉，這樣的調(diào)控為負轉(zhuǎn)錄調(diào)控。當(dāng)前第24頁\共有141頁\編于星期三\0點可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)：指一些基因在特殊的代謝物或化合物（誘導(dǎo)物）的作用下，由原來關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質(zhì)的誘導(dǎo)下使基因活化。例：大腸桿菌的乳糖操縱子分解代謝蛋白的基因2、根據(jù)操縱子對某些能調(diào)節(jié)它們的小分子的應(yīng)答，可分為可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)和可阻遏調(diào)節(jié)兩大類：當(dāng)前第25頁\共有141頁\編于星期三\0點可阻遏調(diào)節(jié)：基因平時是開啟的，處在產(chǎn)生蛋白質(zhì)或酶的工作過程中，由于一些特殊代謝物或化合物（輔阻遏物）的積累而將其關(guān)閉，阻遏了基因的表達。例：色氨酸操縱子

合成代謝蛋白的基因當(dāng)前第26頁\共有141頁\編于星期三\0點3、在負轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白（repressor），起著阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的作用。根據(jù)其作用特征又可分為負控誘導(dǎo)和負控阻遏：在負控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應(yīng)物（誘導(dǎo)物）結(jié)合時，結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄；在負控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應(yīng)物（輔阻遏物）結(jié)合時，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。當(dāng)前第27頁\共有141頁\編于星期三\0點4、在正轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白（activator）。根據(jù)激活蛋白的作用性質(zhì)分為正控誘導(dǎo)和正控阻遏：在正控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子（誘導(dǎo)物）的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)；在正控阻遏系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子（輔阻遏物）的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài)。當(dāng)前第28頁\共有141頁\編于星期三\0點轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)正控誘導(dǎo)正控阻遏負控誘導(dǎo)負控阻遏當(dāng)前第29頁\共有141頁\編于星期三\0點lac體系受調(diào)控的證據(jù)當(dāng)前第30頁\共有141頁\編于星期三\0點β-半乳糖苷酶Noβ–galactosidasewasproducedβ–galactosidasewasproducedE.coliGlucoseE.colilactose當(dāng)前第31頁\共有141頁\編于星期三\0點乳糖的誘導(dǎo)作用是由酶前體轉(zhuǎn)化而來，還是誘導(dǎo)新酶合成？培養(yǎng)基（35S-aa,無乳糖）→E.coli繁殖→培養(yǎng)基（無35S-aa,加入乳糖）→β-gal(無35S)分解底物的酶只有在底物存在時才出現(xiàn)！當(dāng)前第32頁\共有141頁\編于星期三\0點乳糖操縱子（負控誘導(dǎo)）調(diào)控模型Z、Y、A基因的產(chǎn)物由同一條多順反子的mRNA分子所編碼

當(dāng)前第33頁\共有141頁\編于星期三\0點這個mRNA分子的啟動子緊接著O區(qū)，而位于I與O之間的啟動子區(qū)（P），不能單獨起動合成β-半乳糖苷酶和透過酶的生理過程。當(dāng)前第34頁\共有141頁\編于星期三\0點操縱位點的回文序列操縱基因是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結(jié)合位點。當(dāng)前第35頁\共有141頁\編于星期三\0點當(dāng)阻遏物與操縱基因結(jié)合時，lacmRNA的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制當(dāng)前第36頁\共有141頁\編于星期三\0點誘導(dǎo)物通過與阻遏物結(jié)合，改變它的三維構(gòu)象，使之不能與操縱基因結(jié)合，從而激發(fā)lacmRNA的合成當(dāng)前第37頁\共有141頁\編于星期三\0點組成型突變：lacOc

當(dāng)前第38頁\共有141頁\編于星期三\0點組成型突變：

lacI-當(dāng)前第39頁\共有141頁\編于星期三\0點不可誘導(dǎo)突變（超阻遏）：當(dāng)前第40頁\共有141頁\編于星期三\0點lac操縱子的本底水平表達有兩個矛盾是操縱子理論所不能解釋的：①誘導(dǎo)物需要穿過細胞膜才能與阻遏物結(jié)合，而轉(zhuǎn)運誘導(dǎo)物需要透過酶，后者的合成又需要誘導(dǎo)。解釋：一些誘導(dǎo)物可以在透過酶不存在時進入細胞？一些透過酶可以在沒有誘導(dǎo)物的情況下合成？√當(dāng)前第41頁\共有141頁\編于星期三\0點②真正的誘導(dǎo)物是異構(gòu)乳糖而非乳糖，前者是在β-半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有β-半乳糖甘酶的預(yù)先存在。解釋：本底水平的組成型合成：非誘導(dǎo)狀態(tài)下有少量的lacmRNA合成。當(dāng)前第42頁\共有141頁\編于星期三\0點Lac操縱子中的其他問題1、A基因及其生理功能半乳糖甘分子（IPTG）β-半乳糖甘酶分解產(chǎn)物（體內(nèi)積累）β-半乳糖甘乙?；D(zhuǎn)移酶半乳糖甘分子（IPTG）乙酰基當(dāng)前第43頁\共有141頁\編于星期三\0點β-半乳糖苷酶：透過酶：乙?；D(zhuǎn)移酶=1：0.5：0.2翻譯水平上受到調(diào)節(jié)：（1）lacmRNA可能與翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質(zhì)鏈的翻譯；（2）在lacmRNA分子內(nèi)部，A基因比Z基因更容易受內(nèi)切酶作用發(fā)生降解。2、lac基因產(chǎn)物數(shù)量上的比較當(dāng)前第44頁\共有141頁\編于星期三\0點轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的其他形式1、σ因子的更換

在E.coli中,當(dāng)細胞從基本的轉(zhuǎn)錄機制轉(zhuǎn)入各種特定基因表達時，需要不同的因子指導(dǎo)RNA聚合酶與各種啟動子結(jié)合。當(dāng)前第45頁\共有141頁\編于星期三\0點大腸桿菌中的各種σ因子比較σ因子編碼基因主要功能σ70rpoD參與對數(shù)生長期和大多數(shù)碳代謝過程基因的調(diào)控σ54rpoN參與多數(shù)氮源利用基因的調(diào)控σ38rpoH分裂間期特異基因的表達調(diào)控σ32rpoS熱休克基因的表達調(diào)控σ28rpoF鞭毛趨化相關(guān)基因的表達調(diào)控σ24rpoE過度熱休克基因的表達調(diào)控當(dāng)前第46頁\共有141頁\編于星期三\0點溫度較高,誘導(dǎo)產(chǎn)生各種熱休克蛋白由σ32參與構(gòu)成的RNA聚合酶與熱休克應(yīng)答基因啟動子結(jié)合,誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的熱休克蛋白,適應(yīng)環(huán)境需要?？莶菅挎邨U菌芽孢形成有序的σ因子的替換,RNA聚合酶識別不同基因的啟動子,使芽孢形成有關(guān)的基因有序地表達。當(dāng)前第47頁\共有141頁\編于星期三\0點2、降解物對基因活性的調(diào)節(jié)如果將葡萄糖和乳糖同時加入培養(yǎng)基中，lac操縱子處于阻遏狀態(tài)，不能被誘導(dǎo)；一旦耗盡外源葡萄糖，乳糖就會誘導(dǎo)lac操縱子表達分解乳糖所需的三種酶。葡萄糖效應(yīng)或降解物抑制作用當(dāng)前第48頁\共有141頁\編于星期三\0點3、弱化子對基因活性的影響當(dāng)操縱子被阻礙，RNA合成被終止時，起終止轉(zhuǎn)錄信號作用的一段核甘酸被稱為弱化子。當(dāng)前第49頁\共有141頁\編于星期三\0點4、細菌的應(yīng)急反應(yīng)應(yīng)急反應(yīng)信號是鳥甘酸四磷酸（ppGpp）和鳥甘酸五磷酸（ppGpp）。當(dāng)氨基酸缺乏時，tRNA會激活焦磷酸轉(zhuǎn)移酶，使ppGpp大量合成，而ppGpp將關(guān)閉許多基因，同時也將打開一些合成氨基酸的基因，以應(yīng)付緊急情況。當(dāng)前第50頁\共有141頁\編于星期三\0點2、真核生物的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后加工真核生物的RNA聚合酶增強子、啟動子真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄調(diào)控當(dāng)前第51頁\共有141頁\編于星期三\0點真核生物的RNA聚合酶RNA聚合酶IRNA聚合酶IIRNA聚合酶III存在于核仁中存在于核質(zhì)中存在于核質(zhì)中合成5.8SrRNA,18SrRNA,28SrRNA合成mRNA,snRNA合成5SrRNA,tRNA,轉(zhuǎn)錄Alu序列細胞器RNA聚合酶：核基因編碼，在細胞質(zhì)中合成當(dāng)前第52頁\共有141頁\編于星期三\0點啟動子和增強子當(dāng)前第53頁\共有141頁\編于星期三\0點尋找啟動子元件和調(diào)控因子當(dāng)前第54頁\共有141頁\編于星期三\0點(A)(B)(C)(D)當(dāng)前第55頁\共有141頁\編于星期三\0點復(fù)雜的順反式調(diào)控信息相互作用Yuhetal.Science1998.279:1896基因調(diào)控5當(dāng)前第56頁\共有141頁\編于星期三\0點轉(zhuǎn)錄后加工當(dāng)前第57頁\共有141頁\編于星期三\0點5’端加帽3’端加尾RNA的剪接RNA的編輯當(dāng)前第58頁\共有141頁\編于星期三\0點mRNA5’端的一個核苷酸總是7-甲基鳥核苷三磷酸(m7Gppp),這種結(jié)構(gòu)稱為帽子（cap）。帽子可分為三種不同的類型:O型為m7GpppN；I型為m7-GpppN1mp，即轉(zhuǎn)錄出的mRNA的第一位堿基也被甲基化(C2甲基化)；II型為m7GpppN1mpN2mp，即mRNA的第一個堿基和第二個堿基均被甲基化。5’端帽子的結(jié)構(gòu)和功能當(dāng)前第59頁\共有141頁\編于星期三\0點帽子的功能:能被核糖體小亞基識別，促使mRNA和核糖體的結(jié)合；m7Gppp結(jié)構(gòu)能有效地封閉mRNA5’末端，以保護mRNA免受5’核酸外切酶的降解，增強mRNA的穩(wěn)定。當(dāng)前第60頁\共有141頁\編于星期三\0點3’端加尾：多聚腺苷酸尾巴AAUAAA：★準(zhǔn)確切割★加poly（A）當(dāng)前第61頁\共有141頁\編于星期三\0點多聚腺苷酸尾巴的功能：與hnRNA從核內(nèi)移出有關(guān)；抵抗外切核酸酶從3‘端降解mRNA，提高了mRNA在細胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。有些真核細胞mRNA，如組蛋白mRNA，呼腸弧病毒及一些植物病毒mRNA上沒有poly(A)。當(dāng)前第62頁\共有141頁\編于星期三\0點polyA用于mRNA的純化當(dāng)前第63頁\共有141頁\編于星期三\0點RNA的剪接當(dāng)前第64頁\共有141頁\編于星期三\0點rRNA的加工：分子內(nèi)的切割和化學(xué)修飾當(dāng)前第65頁\共有141頁\編于星期三\0點利用多個5’端轉(zhuǎn)錄起始位點或剪接位點產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。當(dāng)前第66頁\共有141頁\編于星期三\0點利用多個加多聚（A）位點和不同的剪接方式產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。當(dāng)前第67頁\共有141頁\編于星期三\0點參與RNA剪接的物質(zhì)：snRNA（核內(nèi)小分子RNA）snRNP（與snRNA結(jié)合的核蛋白）在研究rRNA前體的加工過程中發(fā)現(xiàn)了具有催化作用的RNA分子，稱為酶RNA，從而打破了酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念當(dāng)前第68頁\共有141頁\編于星期三\0點RNA的編輯：編輯（editing）是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的突變、加入或丟失等現(xiàn)象。當(dāng)前第69頁\共有141頁\編于星期三\0點堿基的突變當(dāng)前第70頁\共有141頁\編于星期三\0點尿苷酸的缺失和添加1986.R.Benne在研究錐蟲線粒體mRNA轉(zhuǎn)錄加工時發(fā)現(xiàn)mRNA的多個編碼位置上加入或丟失尿苷酸，1990年在高等動物和病毒中也發(fā)現(xiàn)了編輯現(xiàn)象。當(dāng)前第71頁\共有141頁\編于星期三\0點錐蟲coxII基因的編輯當(dāng)前第72頁\共有141頁\編于星期三\0點特定的反式作用因子(trans-actingfactor，又稱跨域作用因子)與順式作用元件(cis-acting，element)相互作用。順式作用元件—可影響自身基因表達活性的DNA序列，通常是非編碼序列，并非都位于轉(zhuǎn)錄起點上游。它們由若干DNA序列元件組成，它們常與特定的功能基因連鎖在一起。真核生物啟動子、增強子、終止子、沉默子和絕緣子。轉(zhuǎn)錄調(diào)控當(dāng)前第73頁\共有141頁\編于星期三\0點啟動子核心啟動子--保證RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的、最少的DNA序列。單獨起作用時，只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點并產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。上游啟動子元件--調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率，提高轉(zhuǎn)錄效率。典型啟動子：TATA盒，組織特異元件不典型啟動子：基礎(chǔ)水平表達，轉(zhuǎn)錄起始不規(guī)則當(dāng)前第74頁\共有141頁\編于星期三\0點(1)增強效應(yīng)十分明顯；(2)增強效應(yīng)與其位置和取向無關(guān)；(3)大多為重復(fù)序列，適合與蛋白因子結(jié)合；(4)借助啟動子發(fā)揮作用，但沒有基因?qū)Ｒ恍?，可以在不同的基因組合上表現(xiàn)增強效應(yīng)；(5)許多增強子受外部信號的調(diào)控，如金屬硫蛋白基因啟動區(qū)上游所帶的增強子，就可以對環(huán)境中的鋅、鎬濃度做出反應(yīng)。增強子當(dāng)前第75頁\共有141頁\編于星期三\0點終止子：終止密碼下游AATAAA序列及其下游的反向重復(fù)序列，是轉(zhuǎn)錄終止信號，沉默子：當(dāng)其結(jié)合特異蛋白因子時對基因轉(zhuǎn)錄起阻抑作用，最早在酵母中發(fā)現(xiàn)，以后在T抗原受體基因上發(fā)現(xiàn)，作用不受序列方向影響，能遠距離發(fā)揮作用，可作用于異源基因絕緣子：位于啟動子與增強子或沉默子之間，能絕緣啟動子免受上游增強子影響當(dāng)前第76頁\共有141頁\編于星期三\0點反式作用因子--參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的蛋白質(zhì)，它們能識別或者結(jié)合在各類順式作用元件核心序列上(如:上游調(diào)控元件或增強子區(qū)域)。這些因子有兩種獨立的活性:特異地與DNA結(jié)合位點相結(jié)合，然后激活轉(zhuǎn)錄。兩種活性可以獨立分配給特定的蛋白結(jié)構(gòu)域，分別稱作DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激活結(jié)構(gòu)域，兩者是相分離的。它們在蛋白質(zhì)的不同區(qū)域。兩類：RNA聚合酶結(jié)合啟動子所必需的因子，所有轉(zhuǎn)錄過程共有；特異轉(zhuǎn)錄因子，個別基因轉(zhuǎn)錄必需，決定該基因的時序特異表達當(dāng)前第77頁\共有141頁\編于星期三\0點DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域鋅指結(jié)構(gòu)域：“C2H2”型鋅指和C4鋅指結(jié)構(gòu)二聚體結(jié)構(gòu)域：亮氨酸拉鏈和螺旋-環(huán)-螺旋（HLH）結(jié)構(gòu)域堿性結(jié)構(gòu)域：堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)和堿性HLH蛋白當(dāng)前第78頁\共有141頁\編于星期三\0點Cys2/Cys2鋅指Cys2/His2鋅指見于甾體激素受體見于SP1，TFⅢA等當(dāng)前第79頁\共有141頁\編于星期三\0點轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域酸性激活結(jié)構(gòu)域：含有很高比例的酸性氨基酸，且是許多轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的特征富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域：是在轉(zhuǎn)錄因子SPl的二個激活區(qū)域上首次發(fā)現(xiàn)的。與酸性結(jié)構(gòu)域一樣，谷氨酰胺殘基所占的比例很重要。富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域：有一個能激活轉(zhuǎn)錄的連續(xù)脯氨酸殘基鏈。當(dāng)前第80頁\共有141頁\編于星期三\0點阻抑物結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄的阻抑有可能是通過間接地對激活因子功能的干擾而實現(xiàn)的，有以下幾種情況:阻斷了激活因子的DNA結(jié)合位點(與原核生物的阻抑蛋白一樣)并非阻礙DNA結(jié)合而是掩蓋了激活結(jié)構(gòu)域。當(dāng)前第81頁\共有141頁\編于星期三\0點激活結(jié)構(gòu)域調(diào)控的對象激活結(jié)構(gòu)城多樣性的存在給我們提出了一個問題，即在起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中它們的調(diào)控對象是相同的還是不同的?酸性激活結(jié)構(gòu)域可以從下游的增強子位點激活轉(zhuǎn)錄，而富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域的激活力很弱，富含谷氨酰氨根本無法激活;在酵母中富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域和酸性結(jié)構(gòu)域具有活性，而富含谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)域則沒有活性，這些都表明激活結(jié)構(gòu)域有著不同的調(diào)控對象。當(dāng)前第82頁\共有141頁\編于星期三\0點不同的轉(zhuǎn)錄激活因子調(diào)控的對象是不一樣的，可能的情況有以下幾種:·染色質(zhì)結(jié)構(gòu);·與TFⅡD作用;·與TFⅡB作用;·對TFⅡH復(fù)合體的調(diào)整和作用。不同的激活結(jié)構(gòu)域有著不同的調(diào)控對象，而且轉(zhuǎn)錄起始和延伸過程的任何組分或階段都可能成為調(diào)控的對象，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的多階段調(diào)控。當(dāng)前第83頁\共有141頁\編于星期三\0點DomainswapexperimentsAeukaryotictranscriptionalactivatorbearingtheDNAspecificityofaprokaryoticrepressor.BrentR,PtashneM.Cell,1985Dec;43(3Pt2):729-36.

Introduction當(dāng)前第84頁\共有141頁\編于星期三\0點Hochheimeretal.GenesDev.2003,17:1309-1320Thetranscriptionapparatusisamultilayeredensembleofmultisubunitcomplexes.ZFPtranscriptionfactors當(dāng)前第85頁\共有141頁\編于星期三\0點6ZFs→18bp418=6.87×1010C2H2Zincfingerwithsingle-genespecificityZincfinger當(dāng)前第86頁\共有141頁\編于星期三\0點Transcriptionfactors(TFs)ZFPtranscriptionfactors當(dāng)前第87頁\共有141頁\編于星期三\0點Transcriptionfactors(TFs)TranscriptionfactorsareproteinsthatbindtoDNAandregulategeneexpression.ZFPtranscriptionfactors當(dāng)前第88頁\共有141頁\編于星期三\0點Artificialtranscriptionfactors

(ATFs)ZFPtranscriptionfactors當(dāng)前第89頁\共有141頁\編于星期三\0點Modulardesignofartificialtranscriptionfactors.CurrOpinChemBiol,2002,6(6):765–772FunctionalDomainsActivationdomainsRepressiondomainsZFPtranscriptionfactors當(dāng)前第90頁\共有141頁\編于星期三\0點KRABrepressiondomainKRABisthe1-75amminoacidsfromKOX1,whichisawellknowntranscriptionalrepressionfactor.ZFPtranscriptionfactors當(dāng)前第91頁\共有141頁\編于星期三\0點Allcellsinanindividual'sbodycontainthesamesetofgenes.

However,onlyafractionofthesegenesareturnedon,orexpressed,inanindividualcellatanygiventime.ZFPtranscriptionfactors當(dāng)前第92頁\共有141頁\編于星期三\0點ZFPtranscriptionfactorsItisthepatternofgeneexpressionthatdeterminesthestructure,biologicalfunction,andhealthofallcells,tissues,andorganisms.Theaberrantexpressionofcertaingenescanleadtodisease.HLTFgenesilencinginhumancoloncancerBeta-mediterraneananemiaExamples:當(dāng)前第93頁\共有141頁\編于星期三\0點ZFPtranscriptionfactorsGenetherapy:VEGF-A(fordiabeticneuropathy,etc.)MouseeartreatedwithacDNAexpressingasingleVegfaisoform.MouseeartreatedwithaVegfa-activatingZFPtranscriptionfactor.當(dāng)前第94頁\共有141頁\編于星期三\0點ZFPtranscriptionfactorsEnhancingproteinproductionAZFPspecificfora9bpsequencewasfusedtotheVP16activationdomain.TheZFPwasstablyintegratedintoDG44CHOcells,creatingthe“CHOZnTM”cellline.Plasmidscarrying10copiesofthis9bpsequenceupstreamofCMVorSV40werecreated.當(dāng)前第95頁\共有141頁\編于星期三\0點ZFPtranscriptionfactorsEnhancingproteinproductionZFP-activatedCMVexpressionvector(SangamotoAmgen)當(dāng)前第96頁\共有141頁\編于星期三\0點ZFPtranscriptionfactorsConstitutiveZFP-TFexpressionboostsIgGproductionto>400%.Enhancingproteinproduction當(dāng)前第97頁\共有141頁\編于星期三\0點ZFPtranscriptionfactorsEnhancingproteinproductionhEPOexpressioninCHOCells當(dāng)前第98頁\共有141頁\編于星期三\0點ZFPTFscanup-ordown-regulatecandidatetherapeuticgenesinahighlyspecificmanner.ZFPTFscanbeusedtoregulatethegenesofhumans,animals,plants,microbesandviruses.ZFPTFsregulatetheendogenouscellulargenethusavoidingtheuseofcDNAthatmayhavepatentrestrictions.WhataretheadvantagesofZFPTFs?ZFPTFscanbeengineeredtoberegulated.ZFPtranscriptionfactors當(dāng)前第99頁\共有141頁\編于星期三\0點EnhancementofForeignGeneExpressioninCHOCellsbyHumanElongationFactor1αSubunitPromoterandArtificialTranscriptionActivatorFactors.ProgBiochemBiophys(生物化學(xué)與生物物理進展),2004,31(2):118-126ZFPtranscriptionfactors當(dāng)前第100頁\共有141頁\編于星期三\0點SV40PromoterZincfingerKRABDownregulateLuciferase(Reportergene)ConstructionofaSV40PromoterSpecificArtificialTranscriptionFactor.ChineseJournalofBiotechnology（生物工程學(xué)報）,2003,19(5):608-612ZFPtranscriptionfactors當(dāng)前第101頁\共有141頁\編于星期三\0點ZFPnucleasesZFPnuclease當(dāng)前第102頁\共有141頁\編于星期三\0點“FokI”withnewsequencespecificityZFPnucleases當(dāng)前第103頁\共有141頁\編于星期三\0點GeneCorrection/InsertionZFPnucleasesThedonorDNAfragment,wasdesignedthatspansthecleavagesiteandcontainsthepropercodingsequence.當(dāng)前第104頁\共有141頁\編于星期三\0點GeneCorrection:WillitbeOK?ZFPnucleasesGFPStopZFPnucleasetargetsiteDonorDNAfragment當(dāng)前第105頁\共有141頁\編于星期三\0點GeneDisruption(Knockout)ZFPnucleasesThebreakisrepairedbyjoiningends,resultinginlossofgeneticinformation.當(dāng)前第106頁\共有141頁\編于星期三\0點HowwonderfultheZFPnucleasesare!ZFPnucleasesEasytouse,noneedforinstruments.Itisa“hitandrun”approach.

Noneedtosustainedpresenceofaninhibitor(comparedwithRNAi)..TransientintroductionoftheZFPnucleases..Makepermanent,stablegeneticchanges.當(dāng)前第107頁\共有141頁\編于星期三\0點SummarySummarySangamoBiosciences,Inc.當(dāng)前第108頁\共有141頁\編于星期三\0點Tuschl,2001轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控：mRNA的選擇性降解當(dāng)前第109頁\共有141頁\編于星期三\0點WhatisRNAinterference?homology-dependentgenesilencingeventstriggeredbydouble-strandedRNA.RNAiCo-suppressionquelling當(dāng)前第110頁\共有141頁\編于星期三\0點DavidBaulcombeRatherthanheighteningpigmentation,aninsertedgeneswitchedcolourproductionoff,creatingvariegatedblooms.co-suppressioncanbeusedtomaketobaccoplantsresistanttotheeffectsofthepotatovirusX.RichJorgensen當(dāng)前第111頁\共有141頁\編于星期三\0點In1995,SuGuo,agraduatestudentworkinginthelabofKennethKemphuesatCornellUniversityinIthaca,NewYork,usedantisensetodisableagenecalledpar-1,whichcontrolssymmetryinC.elegansembryos.Butherresultscontainedastrangefinding:inmanyofGuo'scontrolexperiments—inwhichsheinjected'sense'RNA,duplicatingthetargetmRNAratherthancomplementingit—geneshut-downalsotookplace.當(dāng)前第112頁\共有141頁\編于星期三\0點until1998thatresearchersledbyAndrewFireoftheCarnegieInstitutionofWashingtoninBaltimore,Maryland,andCraigMellooftheUniversityofMassachusettsMedicalSchoolinCambridgefoundthatdouble-strandedRNAworksmuchbetter.Theydubbedthephenomenon'RNAinterference'(RNAi).當(dāng)前第113頁\共有141頁\編于星期三\0點RNAinterferenceisrevealingthefunctionsofgenesinCaenorhabditiselegans.'quelling'inNeurosporacrassasharesgeneticlinkswithRNAinterference.genesilencingiscreatingabuzzamongresearchersofthefruitfly'sgenome當(dāng)前第114頁\共有141頁\編于星期三\0點基因沉默的發(fā)現(xiàn)時間作者對象基因目標(biāo)生物命名1990Napoli和其同事chs矮牽牛（植物）共抑制1994Macino和Cogoni類胡蘿卜素合成基因粗糙紅色鏈孢霉（真菌）靜息作用1995SuGuoPar-1秀麗新小桿線蟲1998AndrewFire和CraigMellounc22、fem1、hlh1、myo3、gfp等基因線蟲RNA干涉當(dāng)前第115頁\共有141頁\編于星期三\0點當(dāng)前第116頁\共有141頁\編于星期三\0點ThemechanismofRNAi當(dāng)前第117頁\共有141頁\編于星期三\0點OverviewofRNAidegradationpathway當(dāng)前第118頁\共有141頁\編于星期三\0點Zamore’smodelofRNAiinDrosophilaandhuman當(dāng)前第119頁\共有141頁\編于星期三\0點ModeloftheoriginandpotentialfunctionsofmicroRNAs當(dāng)前第120頁\共有141頁\編于星期三\0點RNAi’sapplicationsApowerfultoolforfunctionalgenomics;Potentialdrugs.當(dāng)前第121頁\共有141頁\編于星期三\0點Genome-wideRNAiinC.elegans當(dāng)前第122頁\共有141頁\編于星期三\0點TargetIdentification&ValidationCurrentdrugsonthemarkettargetonly~500differentproteinsanditisbelievedthattherearethousandsofnewdrugtargetstobediscovered.

當(dāng)前第123頁\共有141頁\編于星期三\0點Snapshotofthepharmaceuticaldiscoveryprocessandintegrationoffunctionalgenomicstechnologies當(dāng)前第124頁\共有141頁\編于星期三\0點RNAi-APlatformForDrugDevelopmentTargetDiscovery:

Systematicknockdowninsteadofover-expressionorrecombinantapproachLeadGenerationLead

OptimizationPre-ClinicalClinical

Development&INDTargetIDTargetValidationTherapeuticsforgain-offunctiondiseases:topicaldelivery,injection,

genetherapyhighspecificity,lowtoxicityEasiertomanufacturethanproteindrugsValidationpathwaymechanismgene-specificfunctionaldeterminationAnimalModels:regulated,multi-geneknockdownCellBasedAssays:quantitative“high-content”當(dāng)前第125頁\共有141頁\編于星期三\0點StanfordUniversitySchoolofMedicineinCaliforniasilencedindividualgenesinhumancellsinculture.Then,using“genechips,”theymonitoredtheactivityofsome30,000othergenesinthecellsandfoundthatnonehadbeenaffected.當(dāng)前第126頁\共有141頁\編于星期三\0點EvaluatingdrugspecificityusingantisenseorsiRNAsincombinationwithexpressionprofiling當(dāng)前第127頁\共有141頁\編于星期三\0點TherapeutictargetsVirusesandotherinfectiousagentsCancerNeurodegenerativediseaseAutoimmunediseaseOtherindications當(dāng)前第128頁\共有141頁\編于星期三\0點AntiviralstrategiesTargetingviralgenesthatareessentialforreplication;Targetingviralsequencesthatarerelativelyconservedbetweenviralstrains;Inhibitionofhostgenesthatarerequiredforviralentry;Inhibitionofhostgenesthatplayanessentialroleinthevirallifecycle;Simultaneoustargetingofseveralviralorhostgenes.當(dāng)前第129頁\共有141頁\編于星期三\0點Anti-poliovirusinfection當(dāng)前第130頁\共有141頁\編于星期三\0點CancerpointmutationsK-RASv12translocationsBcr–AblinchronicmyeloidleukemiaHPVgenesE6andE7for