細(xì)菌內(nèi)雙組分信號(hào)傳導(dǎo)

一、概念1.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)2.微生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)3.細(xì)菌雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)前第1頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞或者識(shí)別與之相接觸的細(xì)胞，或者識(shí)別周圍環(huán)境中存在的各種化學(xué)和物理信號(hào)并將其轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)各種分子活性的變化，從而改變細(xì)胞的某些代謝過程，影響細(xì)胞的生長速度，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這種針對(duì)外源信息所發(fā)生的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)全過程稱為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signaltransduction)。當(dāng)前第2頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)微生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)微生物是地球上最多變、適應(yīng)性最強(qiáng)的有機(jī)體，尤其是細(xì)菌，能夠在動(dòng)植物無法存活的環(huán)境生長。微生物擁有復(fù)雜而精密的信號(hào)系統(tǒng)來應(yīng)對(duì)體內(nèi)外環(huán)境變化，從而適應(yīng)環(huán)境并得以生存。當(dāng)前第3頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)細(xì)菌雙組分轉(zhuǎn)導(dǎo)1.雙組分系統(tǒng)是廣泛存在于原核和真核細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，主要由組氨酸蛋白激酶（HPK）和響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（RR）兩個(gè)組分組成。2.雙組分系統(tǒng)信號(hào)通路一般包括信號(hào)的輸入、HPK自身磷酸化、信號(hào)輸出等環(huán)節(jié)。當(dāng)前第4頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)3.從細(xì)菌的角度，當(dāng)它入侵宿主體內(nèi)時(shí)，環(huán)境中各種營養(yǎng)物質(zhì)的含量、溫度、滲透壓和PH值等都發(fā)生了改變，同時(shí)一些毒性物質(zhì)也出現(xiàn)在其生存的環(huán)境中，因此，細(xì)菌為了生存，其必然擁有一套特有的對(duì)外部環(huán)境持續(xù)監(jiān)控的信號(hào)系統(tǒng)，以檢測(cè)環(huán)境中各種生理因素的改變，并據(jù)此迅速調(diào)節(jié)自身的結(jié)構(gòu)和生理行為，達(dá)到適應(yīng)新環(huán)境和生存繁殖的目的。當(dāng)前第5頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)二、雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的組成當(dāng)前第6頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)雙組分信號(hào)通路

HPK感受到外界環(huán)境信號(hào)后,使RR磷酸化,將外界信號(hào)傳遞到胞內(nèi).整個(gè)雙組分信號(hào)通路由信號(hào)輸入(input)、HPK自身磷酸化、RR磷酸化及輸出（output)等環(huán)節(jié)構(gòu)成當(dāng)前第7頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的組成

經(jīng)典的雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)由組氨酸激酶[histidinekinase，HPK]又稱為傳感器激酶和反應(yīng)調(diào)控蛋白(responseregulator，RR)組成。雙組分系統(tǒng)只負(fù)責(zé)信號(hào)的輸入、轉(zhuǎn)導(dǎo)、輸出。信號(hào)的識(shí)別和感受是由其他分子,如細(xì)胞表面受體或運(yùn)輸?shù)鞍讈硗瓿?由它們?cè)賹⑿盘?hào)傳遞到HPK。當(dāng)前第8頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的組成組氨酸激酶HPK緊貼最外層跨膜部分，位于胞質(zhì)內(nèi)。是細(xì)菌感應(yīng)各種環(huán)境變化必需的，通常是由兩個(gè)單體組成的同源二聚體膜蛋白，每個(gè)單體含有一個(gè)可變的傳感器結(jié)構(gòu)域和一個(gè)保守的傳遞器結(jié)構(gòu)域。其傳感器結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)檢測(cè)和編碼輸入信息。當(dāng)前第9頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的組成

組氨酸激酶的傳遞器結(jié)構(gòu)域由N端DHp(二聚化組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移)結(jié)構(gòu)域和C端CA(催化結(jié)合ATP)結(jié)構(gòu)域組成。DHp結(jié)構(gòu)域能形成一個(gè)穩(wěn)定的二聚體結(jié)構(gòu)，其上含有一個(gè)能發(fā)生自身磷酸化組氨酸位點(diǎn)；CA催化結(jié)構(gòu)域由保守的N、G1、F和G2盒組成，含有一個(gè)與ATP結(jié)合的基序。DHp和CA結(jié)構(gòu)域連接在一起，使ATP的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DHp上的組氨酸位點(diǎn)上，所有雙組分系統(tǒng)的傳遞器結(jié)構(gòu)域都是保守的。當(dāng)前第10頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的組成反應(yīng)調(diào)控蛋白R(shí)R

位于胞質(zhì)內(nèi)。是雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的第二個(gè)組分，含有一個(gè)或多個(gè)保守的N端接受器結(jié)構(gòu)域又稱為輸入結(jié)構(gòu)域和可變的C端效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域又稱為輸出結(jié)構(gòu)域。反應(yīng)調(diào)控蛋白控制輸出信息。當(dāng)前第11頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的組成反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白在其N端為接收器，大約具有120個(gè)保守性的氨基酸順序和磷酸化位點(diǎn)。C端功能區(qū)具有DNA結(jié)合或其它調(diào)節(jié)功能,對(duì)其目標(biāo)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。接收器元件和輸出功能區(qū)常由易彎曲的銜接物連接。當(dāng)前第12頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的組成

當(dāng)外界或內(nèi)部環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，組氨酸激酶的傳感器結(jié)構(gòu)域能夠感應(yīng)環(huán)境的刺激并迅速二聚化，導(dǎo)致催化ATP依賴的特定的組氨酸殘基自我磷酸化，然后反應(yīng)調(diào)控蛋白催化組氨酸的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到它自身的天門冬氨酸殘基上，反應(yīng)調(diào)控蛋白的磷酸化激活效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域，從而與下游基因的啟動(dòng)子或蛋白作用，產(chǎn)生調(diào)控應(yīng)答反應(yīng)。當(dāng)前第13頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的組成隨著雙組分系統(tǒng)的廣泛研究,尤其是在真菌和高等植物中的研究,發(fā)現(xiàn)雙組分系統(tǒng)遠(yuǎn)非只有兩個(gè)組分,并且無論是信號(hào)的輸入、還是轉(zhuǎn)導(dǎo)或輸出過程,都比原核的雙組分系統(tǒng)復(fù)雜得多。因而,雙組分系統(tǒng)呈現(xiàn)出多樣化的特點(diǎn)。目前研究結(jié)果表明許多雙組分系統(tǒng)含有額外的組成，即調(diào)節(jié)伴侶蛋白,作用是輔助磷酸酶的催化。當(dāng)前第14頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)三、雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

對(duì)生物學(xué)活性的調(diào)控作用當(dāng)前第15頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)1在滲透信號(hào)傳遞過程中的作用2在細(xì)菌趨化過程中作用當(dāng)前第16頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)在滲透信號(hào)傳遞過程中的作用Loremipsumdolorsitamet1當(dāng)前第17頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)雙組分系統(tǒng)在滲透信號(hào)傳遞過程中的作用當(dāng)前第18頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)當(dāng)前第19頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)當(dāng)前第20頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)當(dāng)前第21頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)當(dāng)前第22頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)當(dāng)前第23頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)

在細(xì)菌趨化過程的作用Loremipsumdolorsitamet2當(dāng)前第24頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)以大腸桿菌為例，一個(gè)細(xì)胞有4~10根鞭毛，鞭毛快速旋轉(zhuǎn)使得細(xì)胞具有運(yùn)動(dòng)的能力。鞭毛的運(yùn)動(dòng)方式分為2種：（1）順時(shí)針旋轉(zhuǎn)(clockwise，CW)：當(dāng)鞭毛順時(shí)針旋轉(zhuǎn)時(shí)，細(xì)胞鞭毛分開，原地做翻滾運(yùn)動(dòng)，來調(diào)整運(yùn)動(dòng)方向。這種方式成為翻滾。（圖1-A)（2）逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)(counter-clockwise，CCW)：當(dāng)鞭毛逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)時(shí)，鞭毛擰成一束，產(chǎn)生向前的推動(dòng)力。這種方式稱為泳動(dòng)。（圖1-B）在復(fù)雜的環(huán)境中，細(xì)菌不斷地調(diào)整鞭毛的運(yùn)動(dòng)方式來趨利避害。當(dāng)前第25頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)趨化受體感知環(huán)境信號(hào)并引發(fā)刺激反應(yīng)，刺激信號(hào)通過CheA（組氨酸激酶）和CheY（反應(yīng)調(diào)節(jié)器）傳遞給鞭毛馬達(dá)。CheA和CheY是雙組分調(diào)控系統(tǒng)家族的代表性成員，執(zhí)行細(xì)菌中大多數(shù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。組氨酸激酶CheA是細(xì)菌趨化性的重要元件，擁有CheA的微生物都具有趨化特性。CheA是唯一的組氨酸激酶能夠被分為5個(gè)明顯的作用區(qū)域N-末端磷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(HPT)，YB識(shí)別反應(yīng)調(diào)節(jié)器區(qū)域，二聚體結(jié)構(gòu)域（不同于其他組氨酸激酶），催化激酶區(qū)域(CA)，CheW結(jié)合區(qū)域(R)。和所有組氨酸激酶一樣，CheA以二聚體的形式發(fā)揮作用，一個(gè)亞基的激酶區(qū)域使另一個(gè)亞基保守組氨酸磷酸化當(dāng)前第26頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)趨化反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈RR蛋白是CheY。CheY直接和鞭毛馬達(dá)的轉(zhuǎn)換蛋白FliM相互作用，引發(fā)旋轉(zhuǎn)方式的改變。CheY一結(jié)合到CheA的YB區(qū)域，磷酰基基團(tuán)從保守的組氨酸傳遞給CheY保守的天冬氨酸。CheY的磷酸化導(dǎo)致構(gòu)象的改變，從而導(dǎo)致對(duì)CheA的吸引力下降，對(duì)馬達(dá)蛋白FliM的吸引力增加。磷酸化的CheY從CheA上釋放，與鞭毛馬達(dá)蛋白結(jié)合，最終，趨化受體感知的環(huán)境信號(hào)被傳遞給了馬達(dá)，使得微生物發(fā)生位移。當(dāng)前第27頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)組氨酸激酶CheA與甲基趨化受體MCP的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)區(qū)域由連接因子CheW連接，形成一個(gè)MCP-CheW-CheA三元復(fù)合體CheA蛋白是雙組份調(diào)控系統(tǒng)中的傳感激酶，在ATP存在的情況下可發(fā)生自我磷酸化，將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給CheY，使CheY發(fā)生磷酸化許多鞭毛馬達(dá)旋轉(zhuǎn)方向由細(xì)胞內(nèi)CheY和CheY-P的比率來控制，鞭毛馬達(dá)的逆時(shí)針和順時(shí)針構(gòu)象是以平衡狀態(tài)存在的。CheY-P與FliM和FliN（轉(zhuǎn)動(dòng)復(fù)合物的成分）結(jié)合，使鞭毛傾向于進(jìn)行順時(shí)針旋轉(zhuǎn)。FliM和FliN上具有34個(gè)CheY-P結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)被占據(jù)的越多，鞭毛順時(shí)針旋轉(zhuǎn)相應(yīng)地上升。最終調(diào)解運(yùn)動(dòng)方向當(dāng)前第28頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)當(dāng)前第29頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)四、雙組分系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究方法當(dāng)前第30頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)1.信號(hào)蛋白分子定位研究

免疫熒光技術(shù)（IF)、流式細(xì)胞免疫熒光技術(shù)FCM當(dāng)前第31頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)2.信號(hào)蛋白分子表達(dá)水平及磷酸化檢測(cè)

RT-PCR/Real-timePCR（mRNA水平）Westernblot檢測(cè)通路關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)（蛋白水平）

磷酸化狀態(tài)，蛋白質(zhì)分子間的相互結(jié)合的技術(shù)PhosphoELISA試劑盒（雙抗體夾心）

測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)量或磷酸化狀態(tài)當(dāng)前第32頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)3檢測(cè)通路相互作用蛋白

免疫共沉淀技術(shù)（Co-lP）當(dāng)前第33頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）當(dāng)前第34頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)4關(guān)鍵信號(hào)分子基因沉默

抑制劑/siRNA/基因敲除動(dòng)物5蛋白質(zhì)與DNA相互作用當(dāng)前第35頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)當(dāng)前第36頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)五、雙組分系統(tǒng)研究過程1986年，Ninfa和Magasnik在研究大腸桿菌氮調(diào)節(jié)蛋白系統(tǒng)時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了雙組分系統(tǒng)，用DNA序列鑒定了其基因。2005年，Ulrich等對(duì)145種細(xì)菌基因組進(jìn)行了測(cè)序，在此過程中他們發(fā)現(xiàn)了至少4000對(duì)雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。當(dāng)前第37頁\共有38頁\編于星期四\7點(diǎn)革蘭氏陽性菌VicRK(YycFG)系統(tǒng)1.VicRK(YycFG)