膠體金的制備方法

第一節(jié)免疫膠體金的制備一、膠體金的特性和制備（一） 膠體金的結(jié)構(gòu)膠體金（colloidalgold）也稱金溶膠（goldsol），是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子（AuC12-），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。膠體金顆粒的基礎(chǔ)金核并非是理想的圓球核，較小的膠體金顆?；臼菆A球形的，較大的膠體金顆粒（一般指大于30nm以上的）多呈橢圓形。在電子顯微鏡下可觀察膠體金的顆粒形態(tài)。（二） 膠體金的特性膠體性質(zhì)膠體金顆粒大小多在1?100nm，微小金顆粒穩(wěn)定地、均勻地、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中，成為膠體金溶液。膠體金因而具有膠體的多種特性，特別是對(duì)電解質(zhì)的敏感性。電解質(zhì)能破壞膠體金顆粒的外周永水化層，從而打破膠體的穩(wěn)定狀態(tài)，使分散的單一金顆粒凝聚成大顆粒，而從液體中沉淀下來(lái)。某些蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)有保護(hù)膠體金、加強(qiáng)其穩(wěn)定性的作用。呈色性微小顆粒膠體呈紅色，但不同大小的膠體呈色有一定的差別。最小的膠體金（2?5nm）是橙黃色的，中等大小的膠體金（10?20nm）是酒紅色的，較大顆粒的膠體金（30?80nm）則是紫紅色的。根據(jù)這一特點(diǎn)，用肉眼觀察膠體金的顏色可粗略估計(jì)金顆粒的大小。光吸收性膠體金在可見(jiàn)光范圍內(nèi)有一單一光吸收峰，這個(gè)光吸收峰的波長(zhǎng)（入max）在510?550nm范圍內(nèi)，隨膠體金顆粒大小而變化，大顆粒膠體金的入max偏向長(zhǎng)波長(zhǎng)，反之，小顆粒膠體金的入max則偏于短波長(zhǎng)，表19-1所列為部分膠體金的入max。（三） 膠體金的制備制備方法膠體金的制備多采用還原法。氯金酸（HauC14）是主要還原材料，常用還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。根據(jù)還原劑類型以及還原作用的強(qiáng)弱，可以制備0.8nm?150nm不等的膠體金。最常用的制備方法為檸檬酸鹽還原法。具體操作方法如下：（1） 將HauC14先配制成0.01%水溶液，取100ml加熱至沸。（2） 攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入一定量的1%檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7?2H2O）水溶液。（3） 繼續(xù)加熱煮沸15min。此時(shí)可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過(guò)程約2?3min。（4） 冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積。用此法可制備16?147nm粒徑的膠體金。金顆粒的大小取決于制備時(shí)加入的檸檬酸三鈉的量。表19-1列舉制備4種不同粒徑膠體金時(shí)檸檬酸三鈉的用量。表19-1四種粒徑膠體金的制備及特性膠體金粒徑（nm）1%檸檬酸三鈉加入量（ml）*膠體金特性呈色 入max162.00橙色518nm24.51.50橙紅522nm411.00紅色525nm71.50.70紫色535nm*還原100ml0.01%HauC14所需量注意事項(xiàng)（1） 氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。（2） 氯金酸對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，因此在配制氯金酸水溶液時(shí)，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。（3） 用于制備膠體金的蒸餾水應(yīng)是雙蒸餾水或三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水。（4） 是以制備膠體金的玻璃容器必須是絕對(duì)清潔的，用前應(yīng)先經(jīng)酸洗并用蒸餾水沖凈。最好是經(jīng)硅化處理的，硅化方法可用5%二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數(shù)分鐘，用蒸餾水沖凈后干燥備用。（5） 膠體金的鑒定和保存：膠體金的制備并不難，但要制好高質(zhì)量的膠體金卻也并非易事。因此對(duì)每次制好的膠體金應(yīng)加以檢定，主要檢查指標(biāo)有顆粒大小，粒徑的均一程度及有無(wú)凝集顆粒等。肉眼觀察是最基本也是最簡(jiǎn)單和方便的檢定方法，但需要一定的經(jīng)驗(yàn)。良好的膠體金應(yīng)該是清亮透明的，若制備的膠體金混濁或液體表面有漂浮物，提示此次制備的膠體金有較多的凝集顆粒。在日光下仔細(xì)觀察比較膠體金的顏色，可以粗略估計(jì)制得的金顆粒的大小。當(dāng)然也可用分光光度計(jì)掃描久max來(lái)估計(jì)金顆粒的粒徑。結(jié)制備的膠體金最好作電鏡觀察，并選一些代表性的作顯微攝影，可以比較精確地測(cè)定膠體金的平均粒徑。膠體金在潔凈的玻璃器皿中可較長(zhǎng)時(shí)間保存，加入少許防腐劑（如0.02%NaN3）可有利于保存。保存不當(dāng)時(shí)會(huì)有細(xì)菌生長(zhǎng)或有凝集顆粒形成。少量凝集顆粒并不影響以后膠體金的標(biāo)記，使用時(shí)為提高標(biāo)記效率可先低速離心去除凝集顆粒。二、免疫金的特性和制備（一） 免疫金的特性膠體金可以和蛋白質(zhì)等各種大分子物質(zhì)結(jié)合，在免疫組織化學(xué)技術(shù)中，習(xí)慣上將膠體金結(jié)合蛋白質(zhì)的復(fù)合物稱為金探針。用于免疫測(cè)定時(shí)膠體金多與免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體）結(jié)合，這類膠體金結(jié)合物常稱為免疫金復(fù)合物，或簡(jiǎn)稱免疫金（immunogold）。膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合的機(jī)制尚有十分清楚，一般認(rèn)為是物理吸附性的。膠體金顆粒帶有一層表面陰性電荷，與蛋白質(zhì)表面的陽(yáng)性電荷通過(guò)靜電感應(yīng)相附。因此環(huán)境pH和離子強(qiáng)度是影響吸附的主要因素，其他如膠體金顆粒的大小、蛋白質(zhì)的分子量及蛋白質(zhì)濃度等也會(huì)影響蛋白質(zhì)的吸附。（二） 免疫金的制備用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至選定值。原則上可選擇待標(biāo)記蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，也可略為偏堿。但通常最適反應(yīng)pH往往需經(jīng)多次試驗(yàn)才能確定。在調(diào)節(jié)膠體金的pH值時(shí)應(yīng)注意，膠體金會(huì)阻塞pH計(jì)的電極，不可直接將電極插入膠體金溶液中，宜先用終濃度為0.15的聚乙二醇（PEG，20000）穩(wěn)定膠體金后，再膠體金的pH值。將1/10體積的合適濃度的蛋白質(zhì)溶液加于膠體金溶液中，放置室溫反應(yīng)2?5min。由于鹽類成分能影響膠體金對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，并可使膠體金聚沉，因此待標(biāo)記蛋白質(zhì)溶液若含有較高的離子濃度，應(yīng)在標(biāo)記前先對(duì)低離子強(qiáng)度的蒸餾水透析去鹽。加入濃度為0.2%的PEG或BSA以飽和游離的膠體金。離心分離，去除上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。離心條件視膠體金顆粒的粒徑而異：對(duì)5nm金顆粒可選用40000r/min離心1h；8nm金顆粒用25000r/min離心45min；14nm金顆粒用25000r/min離心30min，40nm金顆粒用15000r/min離心30min。輕吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的緩沖液懸浮，恢復(fù)原體積后再離心。如此洗滌2?4次。以徹底除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。免疫金復(fù)合物最終用稀釋液配制成工作濃度保存。稀釋液通常是加入穩(wěn)定劑的緩沖液。緩沖溶液常用中性的PBS或Tris緩沖液。多種蛋白質(zhì)、葡聚糖、PEG2000、明膠等均為良好的高分子穩(wěn)定劑，PEG和BSA是最常用的穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑有兩大作用：一為保護(hù)膠體金的穩(wěn)定性，使之便于長(zhǎng)期保存；二為防止或減少免疫金復(fù)合物的非特異性吸附反應(yīng)。穩(wěn)定劑的合理選擇是十分重要的，不適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑有時(shí)也會(huì)導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。第二節(jié)一、 膠體金即金的水溶液，它也具有一般溶膠的特性。分散體系的分類：體系就是一定空間范圍內(nèi)作為我們研究對(duì)象的物質(zhì)，某一種或幾種物質(zhì)分散到另一種物質(zhì)中所組成的體系叫做分散體系。被分散相質(zhì)點(diǎn)的大小而改變，因此，按分散相質(zhì)點(diǎn)的大小不同，可將分散體系分為三類。（一） 離子分散體系指分?jǐn)?shù)散相以小分子或離子狀態(tài)分散著。這種溶液具有高度穩(wěn)定性，無(wú)論放置多久，分散相顆粒都不會(huì)因重力而下沉，不會(huì)從溶液中分離出來(lái)（二） 膠體分散體系是指分散相顆粒在1?100nm之間的分散體系叫做膠體分散系。膠體溶液外觀透明不渾濁，在普通顯微鏡下看不見(jiàn)它的分散相粒子，不易受重力影響與分散介質(zhì)分離沉降，但其中的溶膠粒子有聚結(jié)變大的傾向，即具有聚結(jié)不穩(wěn)定性。（三）粗分散體系分散相顆粒是由許多分子組成，因粒子較大，用肉眼或顯微鏡即可看見(jiàn)，不穩(wěn)定，極易因重力而自動(dòng)沉降，外觀渾濁不透明。二、膠體金的一般性狀（一） 膠體金的顏色溶膠的顏色決定于分散相物質(zhì)的顏色、分散相物質(zhì)的散度和入射光線和種類，是散射光還是透射光，粒子越小，分散度越高，則散射光的波長(zhǎng)越短，對(duì)同一種物質(zhì)的水溶膠來(lái)說(shuō)，粒子大小不同，顏色亦不同，膠體金顆粒在5?20nm之間，吸收波長(zhǎng)520nm，呈葡萄酒紅色，20?40?nm之間吸收波長(zhǎng)530nm，液體為深紅色，60nm的金溶液主要吸收波長(zhǎng)600nm，金溶液呈蘭紫色，若離心去掉較大的金顆粒，溶膠呈紅色。（二） 膠體金的穩(wěn)定性溶膠的穩(wěn)定性介于小分子離子溶液和粗分散系之間，溶膠的顆粒作布朗運(yùn)動(dòng)，不易受重力影響下沉。然而溶膠又是不穩(wěn)定體系，它的膠粒溶劑化作用很弱，總表面積較大，當(dāng)膠粒相互碰撞時(shí)，有自動(dòng)合并為較大、較重的顆粒傾向。膠體顆粒變大以致超出膠體范圍而從介質(zhì)中沉淀出來(lái)的現(xiàn)象叫聚沉。影響溶膠穩(wěn)定性的主要原因有三點(diǎn)：①膠粒間的相互吸引力。當(dāng)膠粒相距很近時(shí)，這種吸引力可能導(dǎo)致膠粒合并變大。②膠粒及其溶劑化層（溶劑是水就是水化層）的帶電情況。一種溶膠的各個(gè)膠粒都帶有相同的電荷。同性電荷相斥，雙電層愈厚，膠粒帶電量愈大，排斥力愈大，愈能阻止膠粒合并聚結(jié)，溶膠愈穩(wěn)定。③膠體界面的溶劑膜，當(dāng)二固體間夾有一厚層液體時(shí)，這層液體膜有一個(gè)反抗二固體接近的排斥力。兩個(gè)膠粒要進(jìn)一步接近，只有克服它們之間的溶劑化膜的斥力才有可能，因此溶劑膜的斥力是使溶膠穩(wěn)定的原因之一。（三） 溶膠的聚沉現(xiàn)象膠粒之間存在吸引力與排斥力這對(duì)矛盾，在溶膠顆粒帶電及溶劑化的情況下，排斥力成為矛盾的主要方面，溶膠穩(wěn)定而不聚沉。因?yàn)槟撤N原因使溶膠顆粒帶電量減到很小甚至中和；其所帶電荷并能去溶劑化膜，膠粒之間可在更近的距離互相接近，引力成為主要矛盾，引力超過(guò)斥力時(shí)膠粒便聚結(jié)發(fā)生聚沉。引起溶膠聚沉的原因有：少量電介質(zhì)對(duì)溶膠的聚沉作用少量電介質(zhì)即可使溶膠聚沉，但各種電介質(zhì)的聚沉能力可用聚沉值來(lái)表示，聚沉值愈小，聚沉能力愈大，聚沉值從實(shí)驗(yàn)中得出如下的離子價(jià)規(guī)則：①電介質(zhì)負(fù)離子對(duì)帶正電的溶膠起主要聚沉作用，正離子對(duì)帶負(fù)電的溶膠起主要聚沉作用。②同價(jià)離子聚沉能力幾乎相等，不同價(jià)離子的聚沉能力隨離子價(jià)的增加而顯著增加。電介質(zhì)為什么能使溶膠聚沉呢？這是由于電介質(zhì)與膠粒帶相反電荷的離子的作用，中和了膠粒所帶的一部分電荷，使膠粒電荷量減少，擴(kuò)散層縮小，溶劑化層變薄，而當(dāng)雙電層厚度縮至很小的溶劑化層變得很薄時(shí)，兩個(gè)膠粒間便可以更加接近即不產(chǎn)生斥力，兩個(gè)膠粒間因引力加大而合并的趨勢(shì)增強(qiáng)，甚至引力占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)以致使膠粒聚結(jié)而發(fā)生聚沉。膠粒的雙電層結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5溫度對(duì)溶膠穩(wěn)定性的影響一般影響不大，當(dāng)溫度升高時(shí)，吸附能力減弱，溶劑化程度降低，溶劑化層變薄，膠粒聚結(jié)，不穩(wěn)定性增加。濃度對(duì)溶膠的穩(wěn)定性的影響濃度增大時(shí)，粒子間距離縮小，引力增加，容易聚結(jié)而發(fā)生聚沉，所以制備比較穩(wěn)定的溶膠，要有一定的合適濃度。作者：寸草心第三節(jié)膠體金的制備方法膠體金溶液的制備有許多種方法，其中最常用的是化學(xué)還原法，基本的原理是向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子變成金原子。目前常用的還原劑有：白磷、乙醇、過(guò)氧化氫、硼氫化鈉、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等，下面分別介紹制備不同大小顆粒的膠體金溶液。一、制備膠體金的準(zhǔn)備（一）玻璃器皿的清潔

制備膠體金的成功與失敗除試劑因素以外玻璃器皿清潔是非常關(guān)鍵的一步。如果玻璃器皿內(nèi)不干凈或者有灰塵落入就會(huì)干擾膠體金顆粒的生成，形成的顆粒大小不一，顏色微紅、無(wú)色或混濁不透明。我們的經(jīng)驗(yàn)是制備膠體金的所有玻璃器皿先用自來(lái)水把玻璃器皿上的灰塵流水沖洗干凈，加入清潔液(重格酸鉀1000g,加入濃硫酸2500ml,加蒸餾水至10000ml)浸泡24h,自來(lái)水洗凈清潔液，然后每個(gè)玻璃器皿用洗潔劑洗3?4次，自來(lái)水沖洗掉洗潔劑，用蒸餾水洗3?4次，再用雙蒸水把每個(gè)器皿洗3?4次，烤箱干燥后備用。通過(guò)此方法的處理玻璃器皿不需要硅化處理，而直接制備膠體金。也可用已經(jīng)制備的膠體金溶液，用同等大不顆粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后棄去，再用雙蒸水洗凈，即可使用，這樣效果更好，因?yàn)闇p少了金顆粒的吸附作用。(二)試劑的配制要求所有配制試劑的容器均按以上要求酸處理洗凈，配制試劑用雙蒸餾水或三蒸餾水。氯化金(HauCl4水溶液的配制：將lg的氯化金一次溶解于雙蒸水中配成1%的水溶液。放在4”c冰箱內(nèi)保存長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月至1年左右，仍保持穩(wěn)定。白磷或黃磷乙醚溶液的配制：白磷在空氣中易燃燒，要格外小心操作。把白磷在雙蒸水中切成小塊，放在濾紙上吸于水份后，迅速放入已準(zhǔn)備好的乙醚中去，輕輕搖動(dòng)，等完全溶解后即得飽和溶液。儲(chǔ)藏于棕色密閉瓶?jī)?nèi)，放在陰涼處保存。二、制備膠體金的方法和步驟(一)白磷還原法白磷還原法(zSigmondy1905年)取1%的HAuq水溶液1ml,加雙蒸水99ml配成0.01%的HAuC^水溶液。用0.2mol/lK2CO3調(diào)pH至7.2。加熱煮沸騰，迅速加入0.5ml20%白磷的飽和乙醚溶液，振蕩數(shù)分鐘至溶液呈現(xiàn)橙紅色時(shí)即成。膠體金的顆粒直徑為3nm左右，大小較均勻。白磷還原法(zSigmondy1905及zSigmondyThiessen1925)取0.6%的HAuCl4水溶液2.5ml，加雙蒸水120ml。用0.2mol/lK2CO3，調(diào)pH至中性。加入1/5飽和度的白磷乙醚溶液1ml(1份白磷4份乙醚)，在室溫振蕩約15min，溶液呈紅褐色，再加熱至典型的葡萄酒紅色，加熱可使乙醚蒸發(fā)，膠體金液體內(nèi)過(guò)量的白磷通入空氣后被氧化，此方法獲得膠體金顆粒的直徑在5?12nm之間。白磷還原法的改良法(Henegouwen1986)取20%飽和度白磷乙醚溶液0.5ml,加雙蒸水60ml。用1%的HAuq水溶液0.75ml,加0.1mol/lK2CO30.6ml,振蕩變成棕紅色。加熱煮沸，至溶液變成透明紅色。使用上述方法增加還原次數(shù)使金顆粒直徑不斷增大，二者之間的關(guān)系見(jiàn)表5-1。還原次數(shù)顆粒直:徑(nm)正負(fù)誤差15.60.926.70.937.90.949.81.35121.0表5-1膠體金顆粒大小與還原次數(shù)之間的關(guān)系此方法主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)化了制備不同大小的顆粒膠體金的手續(xù)和其它試劑的配制，經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)單。另外，在多次還原過(guò)程中氯化金不再形成新的金顆粒，只是在原先金粒子基礎(chǔ)上使它的直徑變大。第一次金顆粒起著“晶核”的作用。由于這一特點(diǎn)，制備的金顆粒相對(duì)均勻一致。(二)抗體血酸還原法(StathisandFabrikanos1958)將在4°(預(yù)冷的1%HAuCl4水溶液1ml,0.2mol/lK2CO31.5ml、雙蒸水25ml混勻。在攪拌下加入1ml0.7%抗壞血酸水溶液，立即呈現(xiàn)紫紅色。加雙蒸水至100ml，加熱至溶液變?yōu)橥该骷t色為止。膠體金顆粒直徑為8?13nm。

(三)檸檬酸三鈉還原法(Frens1973)此方法是由Frens在1973年創(chuàng)立的，制備程序很簡(jiǎn)單，膠體金的顆粒大小較一致，廣為采用。該法一般先將0.01%的HAuCl4溶液加熱至沸騰，迅速加入一定量1%檸檬酸三鈉水溶液，開(kāi)始有些藍(lán)色，然后淺藍(lán)、藍(lán)色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸7?10min出現(xiàn)透明的橙紅色。各種顆粒的膠體金制備詳見(jiàn)表5-2。表5-2檸檬酸三鈉用量與膠體金顆粒直徑的關(guān)系0.01%?HAuCI4(mP1%檸掾酸三鈉(ml)直徑(ml)1005.010.01004.015.01001.525.01001.050.01000.7560.01000.6070.01000.4298.01000.32147.01000.25160按照Frens法還可以制備出其它不同顆粒大小的膠體金出來(lái)。許多研究證明用該法制備膠體金時(shí)金顆粒的大小是檸檬酸三鈉用量的函數(shù)，基本的規(guī)律是檸檬酸三鈉用量多，膠體金顆粒直徑小，檸檬酸三鈉用量越少，腔體金顆粒直徑越大。(四)鞣酸一檸檬酸三鈉還原法(Slot與Gueeze1985年)該法是以1982年Muhlpfordt法為基礎(chǔ)，1985年Slot與Geuze對(duì)該法進(jìn)行了改良，特點(diǎn)是通過(guò)改變鞣酸的用量制備出多種顆粒直徑的膠體金，而且顆粒的直徑均勻一致，很適合于雙標(biāo)及多標(biāo)研究。制備3nm、5nm、10nm、15nm的膠體金顆粒見(jiàn)表5-3。表5-3鞣酸一檸檬酸三鈉還原法A?0.1mol/LK,C0B液直咨(nm)檸械酸鈉(ml)1%HAuClJI):mH,0(ml)工E1%就酸(El)H20(ml)3.340.24 11.S179540.20.7 15.11791